缺血低氧对大鼠心肌产生血管内皮生长因子的影响及其意义

1、    缺血低氧对大鼠心肌产生血管内皮 生长因子的影响及其意义        摘要目的:了解缺血低氧刺激与大鼠心肌血管内皮生长因子(VEGF)产生的关系、意义及其可能机制。方法：1.建立Wistar大鼠急性心肌梗塞模型，将28只大鼠随机分为4组，每组7只：A组正常对照；B组急性心肌梗塞1 d；C组急性心肌梗塞3 d；D组急性心肌梗塞7 d。心肌冰冻切片，免疫组化探测VEGF。2.原代培养大鼠心肌细胞随机分组：单纯缺氧组，A：缺氧培养0 h；B：缺氧培养6 h；C：缺

2、氧培养12 h；D：缺氧培养24 h； 蛋白激酶C（PKC）激动剂波佛酯（PMA）组,A：加入PMA 0 ng/mL;B:加入PMA 10 ng/mL; C：加入PMA 100 ng/mL; D：加入PMA 1 000 ng/mL；均缺氧培养24h;&127;PKC抑制剂chelerythrine(CT)组,A：加入CT 0 nmol/L；B：加入CT 10 nmol/L ；均缺氧培养24 h。免疫组化测定培养心肌细胞中血管内皮生长因子（VEGF）,经计算机扫描，像分析定量。结果：随缺血低氧时间延长，心肌产生VEGF增加，与对照组比较各组均有显著差异，缺血低氧时间与VEGF产生量呈正相

3、关。不同剂量PMA与chelerythrine分别增强及减弱VEGF在缺氧心肌细胞中的表达。结论：缺血低氧强烈刺激心肌产生血管内皮生长因子，缺血心肌通过分泌VEGF对自身具有重要的保护意义。其信号转导途径部分是通过PKC通路实现的。主题词内皮，血管；生长物质；局部缺血；低氧；心肌；蛋白激酶C中分类号R542.2文献标识码A文章编号1000-4718(2000)08-0705-04 Effect of ischemia or hypoxia on vascular endothelial growth factor production in rat myocardium and its sig

4、nificanceHUANG Lan, JIN Jun, XIANG Chang-qing, LI Hong(Department of Cardiology,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)AbstractAIM:To determine the relationship between ischemia,hypoxia and the production of vascular endothelial growth factor in rat myocardium and

5、 its basic mechanism. METHODS:(1) 28 Wistar rats were randomly divided into 4 groups: group A,normal control;group B,1 day's acute myocardial infarction;group C,3 day's acute myocardial infarction;group D, 7 day's acute myocardial infarction. (2) Rat cardiac myocytes cultured were primar

6、ily divided into some groups, hypoxia incubated 24 hours; PMA groups, hypoxia incubated 24 hours with PKC activator (PMA), A 0 ng/mL; B 10 ng/mL; C 100 ng/mL; D 1 000 ng/mL; Chelerythrine groups, hypoxia incubated 24 hours with PKC inhibitor (chelerythrine), A 0 nmol/L; B 10 nmol/L. (3) By computer

7、scanned and quantitated, vascular endothelial growth factor (VEGF) protein was detected with immunohistochemical technique. RESULTS:The longer time of ischemia and hypoxia was, the higher the VEGF production. The relationship was found between the time of ischemia or hypoxia and the production of VE

8、GF. The production of VEGF protein was further promoted by PMA with different concentration, decreased by chelerythrine.CONCLUSION:Ischemia or hypoxia strongly stimulated the production of VEGF in myocardium, which played an important role in autoprotecting of ischemic or hypoxic myocardium. Hypoxia

9、-induced PKC activation is one kind of basic mechanisms in this course.MeSHEndothelium，vascular；Growth substances; Ischemia； Anoxia； Myocardium；Protein kinase C血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种分子量为46 kD的分泌性糖蛋白，1989年被分离纯化1，被认为是一种肝素结合分子，能特异地作用于血管内皮细胞，强烈刺激其增殖，促进侧支血管形成，并对缺血心肌具有保护作用2。但

10、缺血心肌是否分泌VEGF参与这种保护机制尚不清楚，为此本文通过在体心肌缺血、梗塞及离体心肌细胞低氧模型探讨缺血、缺氧对心肌产生VEGF的影响及相关意义,并初步探讨其可能机制。材料和方法一、 材料Wistar大鼠（第三军医大学动物中心），细胞培养液和牛血清（第三军医大学分子生物学教研室），免疫组化试剂盒（北京中山公司），血管内皮生长因子（VEGF）抗体（Santa Cruz）,蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）激动剂波佛酯（phorbol 12-myristate 13-acetate， PMA）& 抑制剂白屈菜红（chelerythrine， CT）（Sigma）

11、。二、动物模型及分组Wistar大鼠，体重150220 g，雌雄不限。参照Drexler3等方法，于大鼠左侧第四或五肋间开胸，暴露心脏，结扎左冠状动脉主干(或左前降支加左旋支)。迅速将心脏复位，关闭胸腔。术后腹腔注射青霉素抗感染。将28只大鼠随机分为4组，每组7只：A组正常对照；B组急性心肌梗塞1 d；C组急性心肌梗塞3 d；D组急性心肌梗塞7 d。在上述各时点，分别断头处死动物，抽血后取出心脏，生理盐水冲洗，梗塞区呈灰白色，壁变薄，非梗塞区呈粉红色。取梗塞与非梗塞交界区心肌组织4 mm×5 mm大小，4%多聚甲醛固定过夜，置液氮中冰冻1 h，冰冻切片。三、细胞培养新生Wistar乳

12、大鼠（3 d），参考Simpson等4的方法，分离并剪碎心室肌，0.1%胰蛋白酶37消化510 min。将收集的细胞悬液滤并离心，弃去上清液，加入M199培养基悬浮分散细胞，送入培养箱(5%CO2-95%空气,37)培养。60 min后，吸出尚未贴壁的细胞悬液，倒置显微镜观察，可见单个细胞或成团细胞呈现不同频率的自发搏动(50160次/min)。原代培养5 d的心肌细胞，更换为无血清培养液，每一培养皿为一观察单位，单纯缺氧组：A，缺氧培养0 h；B，缺氧培养6 h；C，缺氧培养12 h；D，缺氧培养24 h；PMA组：A：加入PMA 0 ng/mL; B：加入PMA10 ng/mL; C:加入

13、PMA 100 ng/mL； D：加入PMA 1 000 ng/mL；均缺氧培养24 h；PKC抑制剂 chelerythrine (CT)组,A:加入CT 0 nmol/L; B:加入CT 10 nmol/L;均缺氧培养24 h。将实验组心肌细胞放入缺氧培养罐中，持续通入5%CO2-95%N2混合气体(5 L/min)，多次抽取罐内气体作血气分析，至PO2为(6.5±0.4) mmHg，37培养。于各时点取出心肌细胞，经PBS冲洗后，以冷丙酮固定15 min,-20冰箱保存备测。四、指标测定（一）血清心肌酶谱抽血后离心分离血清，测定心肌酶谱。（二）心肌组织切片HE染色。（三）心肌细

14、胞及心肌组织切片免疫组化测定VEGF按免疫组织、细胞化学法染色检测。五、统计像分析软件系统像处理定量(灰度扫描反光度值与阳性强度呈反比)，计量数据均以均数±标准差表示，两组资料进行两均数t检验，多组资料进行方差分析。结果一、在体缺血模型心肌损伤证据血清心肌酶谱测定,心肌梗塞B组均显著高于正常对照组（表1）。心肌组织切片HE染色显示，梗塞区心肌纤维溶解断裂，炎性细胞浸润；非梗塞区心肌纤维排列整齐，说明缺血梗塞是强烈的致心肌损伤因素。表1急性心肌梗塞血清心肌酶变化Tab 1Change of serum myocardial enzymes in acute myocardial inf

15、arction rats （<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309190027635" 12 14>±s，n=7）GroupGOT(IU/L)LDH(IU/L)CK-MB(U/L)A62.14±5.1515.28±3.205.98±1.36B86.72±8.38*1 031.30±202.65*328.80±74.67*     *P0.01,vs group A.GOT=glu

16、tamic-oxalacetic transaminase； LDH=lactic dehydrogenase； CK-MB=creatine kinase-MB 二、心肌组织切片，培养心肌细胞免疫组化显示VEGF表达量活体动物模型B、C、D组显著高于A组(P0.01)，且B、C、D组VEGF表达逐渐升高，组间比较差异显著；在离体培养心肌细胞中B、C、D组显著高于A组，P0.01；B、C、D组VEGF表达也逐渐升高，组间比较P0.01；发现不论在活体心肌或离体细胞中，缺血低氧时间延长与VEGF表达量呈正相关（14，见加页）（表2）。表2缺血或低氧对心肌VEGF表达的影响Tab 2Effect

17、of ischemia or hypoxia onVEGF express （<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309190027635" 12 14>±s，n=7）GroupExpress of VEGFAnimal modelCultured cellA35.428±0.81031.381±0.912B26.238±1.134*27.286±0.756*C23.429±0.957*25.190±0.663D20.90

18、5±0.976*#23.571±0.957*#     * P0.01, vs group A; P0.01, vs group B;# P0.01, vs group B,C三、PKC激动剂与抑止剂对缺氧时心肌细胞VEGF表达的影响PMA加入组心肌细胞在缺氧培养24 h后，其VEGF表达显著高于A组（单纯缺氧24 h组）；且随PMA剂量增加而升高；CT加入组心肌细胞VEGF表达量显著低于A组（表3）。 表3PMA或CT对VEGF表达的影响Tab 3Effect of PMA or CT on VEGF express （<&q

19、uot;0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309190027635" 12 14>±s，n=7）GroupExpress of VEGFPMACherythrineA23.571±0.95723.571±0.957B21.381±1.615*27.619±0.731*C19.476±1.152D17.381±1.508*#     *P0.01, vs group A; P0.01, vs group

20、 A,B;# P0.01, vs group A,B,C 讨论冠状动脉血液供应急性、慢性减少及中断是缺血性心脏病最基本的病理生理基础，由此引起心肌组织需氧与供氧的不平衡，从而引发心绞痛、心肌梗塞等，而组织缺氧是这一过程的关键环节。已经发现，组织缺血、缺氧会导致新生血管的增多，以增加血流量，提高缺血组织的氧供，如：高原生活的人群、动物，其肺毛细血管密度增加，增强了氧的摄取量。这一过程可以看做是机体在外界环境刺激下的一种自我保护的反馈性调节反应。VEGF作为一种内皮细胞的有丝分裂原和促血管形成因子，直接特异地作用于血管内皮细胞，引起内皮细胞的增殖，在新生血管生成过程中起着“扳机”样作用。因而有理由

21、推测VEGF也参与了急性心肌缺血、缺氧时的血管再生过程。本实验成功地复制了大鼠急性心肌缺血、梗塞模型，在急性心梗急性期内(1 d、3 d、7 d)观测VEGF在心肌中的表达，发现梗塞组VEGF明显高于正常对照组，且VEGF的产生随梗塞时间的延长而增加。为排除在体神经、体液因素对缺血、梗塞心肌分泌表达VEGF的影响，本实验同时应用离体培养心肌细胞低氧模型，观察低氧对离体培养心肌细胞分泌表达VEGF的影响，发现VEGF在心肌细胞中的表达，缺氧组显著高于对照组，在缺氧6 h、12 h、24 h不同时段，VEGF的产生随时间延长同样增加。因而，本实验不仅在培养细胞中，而且在活体组织中，均证实心肌在缺血

22、、缺氧等病理条件下，反馈性地代偿性增加VEGF的分泌产生。说明机体在急性缺血、缺氧早期，心肌自我保护的代偿性调节反应处于高峰期，对抗缺氧的生理调节反应在急性心梗急性期是随时间延长而增强的。可见，缺氧作为一种病理因素，直接作用于心肌组织，从而启动了心肌自我保护的调节性反应，反馈性地刺激VEGF产生增加，而VEGF与其受体结合后，产生一系列的生物效应，最终促进内皮细胞的有丝分裂，毛细血管生成增多，心肌侧支循环增加，其意义在于增加梗塞缺血区心肌的血液供应，挽救濒死心肌。目前缺氧调节心肌细胞产生VEGF的细胞内信号转导机制仍不完全清楚。Mukhopadhy5等的研究显示：人内皮细胞在缺氧条件下产生VE

23、GF是通过酪氨酸激酶途径转导的。更多的研究证实，缺氧诱导VEGF的表达还存在其它途径6,7。本实验应用PKC激动剂PMA及PKC抑制剂CT探讨PKC通路在心肌细胞缺氧产生VEGF中的作用。结果显示：PMA刺激组其VEGF表达量显著高于缺氧对照组(P0.01)，而PKC抑制剂CT组VEGF表达显著降低(P0.01 )。说明在缺氧状态下，PMA促进心肌细胞分泌产生VEGF，而PKC抑制剂则减弱了此作用，但未完全阻断此过程，证实：缺血、低氧诱导大鼠心肌分泌产生VEGF蛋白增加，其机制部分是通过刺激PKC酶活性增高进而启动细胞内信号转导机制完成的。对于其它信号转导机制的存在尚有待进一步验证。黄岚（第三

24、军医大学附属新桥医院心内科， 重庆 400037）晋军（第三军医大学附属新桥医院心内科， 重庆 400037）向常青（第三军医大学附属新桥医院心内科， 重庆 400037）李洪（第三军医大学附属新桥医院心内科， 重庆 400037）参考文献1Leung DW,Cachianes G,Kuang WJ. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogenJ. Science， 1989，246:13061309.2Banai S,Jaklitsh MT,Shou M,&127;et al. Angiogenic induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by VEGF in dogsJ. Circulation，1994， 89:21832191.3Drexler H,Depenbusch JW,Truog AG,et al. Effects of diltiazem on cardiac function and regional blood at rest and during &127;exercise in a conscio