脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇检验

1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇检验 (一）理化性质 单端孢霉素是由镰刀菌属产生的一类真菌代谢产物，又称单端抱霉烯族化合物，分子中只含有c、h、o三种元素。谷物中自然污染的单端孢霉烯族化合物分离属于a、b两型，化学结构式如下： a、b两型单端孢霉烯族化合物结构中含有12,13-环氧环，认为是其毒性的化学基础。单端泡霉烯族化合物经过体内代谢，脱去环氧环结构，生成一类脱环氧单端孢霉烯族化合物，其毒性将大大降低。b型单端孢霉烯族化合物去环氧环结构后，其结构式如下： 结构式中r1、r2、r3、r4取代基不同，则得到不同的单端孢霉烯族化合物和脱环氧单端孢霉烯族化合物。频繁的有：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(de

2、oxynivalenol, don)、(nivalenol, niv)、脱环氧雪腐镰刀菌烯醇(de-epoxy nivalenol, de-epoxy niv)、脱环氧脱氧雪腐镰刀菌烯醇(de-epoxy deoxynivalenol, de-epoxy don)等。 don和niv的结构都属于单端孢霉烯族化合物中的b型，它们的化学基本结构及理化性质，见表9-2。 表9-2 don、niv化合物的化学基本结构及理化性质 (二)主要来源 don、niv主要是雪腐镰刀菌污染玉米、小麦、大麦、燕麦等谷类植物而产生的代谢产物，其对谷物的污染率和污染水平居单端孢霉烯族化合物之首，且常与其他真菌毒素共存，

3、在赤霉病麦中可检出高含量的don。 (三)毒性与危害 don,niv的毒性主要表现为强细胞毒性和胚胎毒性，低剂量接触则表现为肠胃功能紊乱、免疫系统伤害。猪对该类化合物最敏感，食用霉变的玉米饼、小麦等饲料能引起食欲缺乏、呕吐、全身无力等症状，故又称呕吐毒素。don可以引起人类食管癌,iga肾病、克山病、大骨节病等，而niv在急性毒性、细胞毒性、皮肤毒性等其他生物作用方面均比don强10倍。在谷物中niv常与don一起被检出。 (四)分析办法 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)的分析办法有免疫亲和层析净化高效液相色谱法(gbit 23503)，谷物及其制品中don的测定办法是薄层色谱法和免疫测定法

4、(gbit5009.111)。其他检测办法有高效液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱法等。 二、免疫亲和层析净化-高效液相色谱法 1.甲原理样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)经提取后，滤液过免疫亲和层析柱净化，用高效液相色谱紫外检测器检测，标准曲线法定量。 2分析步骤 (1)样品处理：粮食及其制品试样粉碎、过筛，加入8000，高速搅拌2分钟，依次经滤纸、玻璃纤维滤纸过滤，收集滤液备用；含气酒类样品先脱气，再加，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤，收集澄清滤液备用；酱油、醋、酱及其制品挺直加入，同粮食及其制品试样提取。 (2)净化：将净化柱衔接在玻璃注射器下，提取液以1滴/秒速度通过净化柱，用ph7.0的磷酸

5、盐清洗缓冲液、水依次冲洗净化柱，控制流速12滴/秒。流出液弃去，并抽干小柱。 (3)洗脱：用洗脱结合在亲和柱上的don，供高效液相色谱检测。 (4)测定：色谱参考条件为c18色谱柱(150mm×4.6mm, 5um);柱温35；流淌相为甲醇-水(20+80)，流速0.8ml/min；检测波长218nm。 3办法解释 (1) ph 7.0磷酸盐清洗缓冲液是指含0.8%naci、0.12%na2hpo4、0.02% kh2po4和0.02%kci的水溶液，盐酸调整ph。 (2)本办法除粮食及其制品的检出限为0.5mg/kg外，其他的检出限为0.1mg/kg。 三、薄层色谱法 1原理谷物及

6、其制品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)经提取、净化、浓缩后，用硅胶g薄层板点样、绽开，在一定温度下，薄层板中aici。与don作用，使don在波长365nm紫外光下显蓝色荧光，与标准比较定量。 2分析步骤 (1)样品提取：取粉碎样品，加适量水，用-无水乙醇(8+2)提取，滤纸过滤，取部分滤液，置90水浴上通风挥干。 (2)样品净化：挥干后的残渣用分次溶解，再用少量甲醇-水(4+1)分次洗涤器皿，一并转入分液漏斗中，振摇，油脂进入石油醚层，而don留在甲醇-水层。取甲醇-水提取液加入装有中性和活性炭的层析柱中，过柱速度控制在23ml/min，待甲醇-水提取液过柱快完毕时，再用少量甲醇-水(4+1

7、)淋洗柱，抽滤至柱内无液体流出，收集过柱后的净化液。 (3)点样液制备：将净化液置沸水浴上浓缩至干。趁热加入，加热至沸，使残渣中don充分溶出，冷却至室温后转入浓缩瓶中，浓缩，最后用一定量三氯甲烷-乙腈(4+1)溶解残渣、定容，供薄层色谱分析。 (4)测定：点样和绽开：在硅胶g薄层板上需要点3个点：样品点和定位点，样品点在薄层板基线距左边缘1.8cm位置，定位点位于薄层板顶端1.5cm处，与样品点位置相对应。先将点好样品点和定位点的薄层板用乙醚-丙酮(95+5)或无水乙醚横展，使样品点中don偏离原点，刚好与杂质荧光分开，然后在横展后的薄层板基线上、靠左边与样品点相距0.8cm处点第三点，即标

8、准点，然后纵向绽开，绽开剂为三氯甲烷-丙酮-异丙醇(8+1+1)或三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1);测定：挥干溶剂后，薄层板用365nm紫外光照耀，可见蓝紫色荧光干扰点，此时don不显荧光。将此薄层板置于130烘箱中加热，取出，放冷后，再用365nm紫外光照耀：若don仍不显荧光，需在其次块薄层板上点3个点，分离是样品点十标准点、标准点、定位点，若滴加了标准液的样品点荧光斑点与标准点全都，且位置与定位点相对应，解释试样中don含量为阴性或低于0.05mg/g；若don显荧光，且杂质点也有荧光，而且杂质荧光斑点与don荧光点分开，不干扰don测定，解释试样中含有don，为阳性试样；阳性试样概略定量：在薄层板上点6个点：基线上点试样点和2个标准点，此标准点don含量可为50ng、75ng或100ng；距板顶端1.5cm处点3个标准点，其don含量约为50ng，位置与基线上各点对应。若试样点荧光强度与标准点(如don含量为75ng的标准点)荧光强度全都，则该试样点中don含量为75ng，再按照点样体积、稀释倍数、溶解残渣的三氯甲烷-乙腈混合液体积及与该体积相当的试样质量，对试样中don含量概略定量。 3办法解释 (1)阳性试样概略定量时，薄层板顶端3个标准点是起定位作用，与基线