反转录病毒载体介导EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞的表达

1、阿反转录病毒载体介导EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞的表达本课题得到国家自然科学基金项目(30400515, 30300395 )、教育部高等学校博士学科点专项科研基金项 目( 20030698011)和陕西省自然科学基金项目(2001SM57 )的资助。刘朝晖，许杰华，冯改丰，胡海涛西安交通大学医学院人体解剖与组织胚胎学系，陕西西安(710061)E-mail : huht摘 要：目的构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白( EGFP)的反转录病毒载体并且探 讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法使用基因重组技术构建携带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGF

2、P)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞，计数NIH3T3荧光表达细胞的数量来确定病毒的浓度。使用RV载体感染SK-N-SH细胞，通过流式细胞学荧光检测明确 RV在SK-N-SH细胞的感染效率。结果成功构建了基因转移载体RV/EGFP,确定重组病毒的浓度为 8.3 X 10病毒颗粒/mL。在SK-N-SH细胞RV/ EGFP稳定 转染并有效表达。在 SK-N-SH细胞EGFP的荧光表达显示 RV的转移并且表达的效率达到 30%以上。 结论SK-N-SH细胞能被RV病毒载体有效感染，在转基因细胞株外源基因的 表达长期稳定并且显示 RV病毒载体具有良好的基因转移效率。关键词：SK-N-SH神经

3、母细胞瘤细胞，增强型绿色荧光蛋白，反转录病毒载体体外细胞学实验是疾病的发病和治疗研究中一个重要的手段。它可以根据需要有效地 控制实验条件，能在短期内获得大量条件相同、性状相似且相对均一的实验样本。因此不 断在医学各研究领域广泛应用，在实践中取得了大量有意义的实验资料。SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株属于神经系统来源的肿瘤细胞系，它的可传代性克服了神经元这种分化终末细胞在体外无法分裂增殖传代，生长时间短的缺点。而且SK-N-SH细胞在细胞形态、生理和生化功能方面与原代培养的神经元更为相似2，因此逐渐在神经系统疾病的研究中被广泛应用。在我们利用RV载体构建疾病细胞模型研究中的研究中，通过观察及检测

4、构建的EGFP-RV病毒载体对SK-N-SH细胞株的感染及表达的效率，为下一步的实验提供重要的实 验数据。1材料与方法1.1试剂 pLXSN质粒购自美国 Clontech公司；pBV220/EGFP由华广生物技术公司提供； 脂质体2000购自Invetrogen公司；EcoRI、BamHI核酸内切酶、 T4DNA 连接酶、G418、 Polybrene购自Sigma公司；DMEM 培养基、胎牛血清购自 GIBCO公司。1.2细胞株 SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株购自中科院上海细胞库；HEK293反转录病毒包装细胞系、NIH3T3细胞由华广生物技术公司提供。1.3 构建 pLXSN/APP69

5、5.sw 重组质粒 扩增 pBV220/EGFP 质粒，使用 EcoRI 和 BamHI 双酶切；将pLXSN载体质粒使用 EcoRI和BamHI双酶切，分别回收目的基因片段EGFP和线性化载体pLXSN。将回收的目的片段和载体使用T4DNA连接酶进行连接，16C,16h。连接产物转感受态细菌，挑取X-gal固体平板上的白色单个转化菌落扩增。小量提取质粒并使用EcoRI和BamH I双酶切鉴定，质粒测序正确后进行扩增和大量制备。1.4表达EGFP的重组病毒的包装 复苏HEK293反转录病毒包装细胞系3，分组加入 不同浓度筛选抗生素 G418的选择培养基，两周后，确定 G418筛选剂量(为400

6、mg/L )。将HEK293传代，80%成片时使用脂质体进行 pLXSN/EGFP质粒转染，转染6-8h当细胞的立 体感和界限模糊时终止转染，换用完全培养基培养，待细胞状态恢复后，换用400mg/L的G418选择培养基。两周后未转化细胞已经全部死亡，转化细胞已经生长出细胞克隆。分别挑选出生长旺盛的10个克隆小心移植到 24孔培养板中， G418继续生长筛查，当细胞生 长成片到100%后，收集上清滴定病毒，产生高滴度病毒的细胞克隆进行扩大培养。1.5计算病毒滴度在20mL的完全培养基中加入10mg/L的Polybrene ,使用该液体系列稀释被滴定的病毒原液，从101-108系列稀释。用稀释后的

7、病毒液转染80%成片的NIH3T3细胞，转染48h后用荧光显微镜观察荧光，寻找有荧光的细胞克隆小于10个的稀释浓度，计算病毒滴度。病毒滴度使用cfu/mL表示。集落形成单位（colony forming units , cfu）=筛 选后形成的细胞集落数瘵专染时的稀释倍数。1.6确定重组RV对SK-N-SH细胞株的感染效率复苏SK-N-SH细胞株，待细胞成片达80%时弃去培养基， 加入RV/EGFP重组病毒液2mL和终浓度为10mg/L的Polybrene 促进感染，6h后更换完全培养基恢复细胞状态，以上过程反复3次。3d后在流式细胞仪上检测荧光表达率，确定病毒转染效率。1.7统计方法 使用S

8、PSS10.0数理统计软件处理， 运用组间单因素方差分析检验，数据用2_!_a表示。2结果2.1重组质粒的酶切鉴定重组质粒pLXSN/EGFP的大小为6.6kb，经限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切后，理论上应该产生5.9kb及730bp两个片段（图1C）。经限制性内切酶EcoRI酶解后，获得6.6kb线性化质粒（图1B）。结果显示，重组质粒大小、酶解 片段大小和理论值一致。KbKbKbKbKbKb 3.13D-9.416 6.577 4.361 2 322 2.0271000500tipbp100bp图1重组质粒pLXSN/EGFP的酶切鉴定Fig 1. The identificat

9、ion of recombinant plasmid pLXSN/EGFPA: pLXSN/EGFP plasmid ; B : EcoRI digestion(6.6 kb);C: EcoRI +BamHI digestion(5.9kb and 730bp);D: QNA/Hind 山 marker； E： 100bp DNA marker-3-图2荧光显微镜检测表达荧光的NIH3T3细胞2.2病毒滴度 RV/EGFP 重组病毒液转染 NIH3T3细胞2d后，在以10-6病毒稀释度时1mL的病毒稀释液转染 NIH3T3细胞计数平均观察到有 8.3个具有荧光的细胞克隆（图2）,以公式（cfu

10、 =筛选后形成的细胞集落数 熔专染时的稀释倍数）计算，病毒滴度为8.3 X 106病 毒颗粒/mL。-#-Fig2 The fluorescence expression in the NIH3T3 cell was detected by fluorescence microscope2.3在SK-N-SH细胞株的转染效率流式细胞仪荧光检测结果显示，纵轴为细胞数量，横轴为荧光强度相对值；M1区为正常细胞区，M2区为荧光表达细胞区。在正常对照组细 胞，可见M1区细胞占细胞总数的 99.57%,仅表现为一些弱的自发性荧光，荧光强度平均 值为2.69; M2区细胞占细胞总数的 0.43% ,有一些

11、散在的荧光强度较弱的细胞，荧光强度平均值为13.58（图3A）。在转染EGFP基因细胞组，可见M1区细胞占细胞总数的 65.80%, M2区细胞占细胞总数的 34.20%，荧光强度平均值为 89.57,显示表达EGFP细胞的数量和 荧光强度显著增高（图3B）,表明RV对SK-N-SH细胞株的转染及表达效率达到34.20%。031221. 001317 :All100.0079.8?2 69S-45All100.0040 3819.27W3299 5?9 $32 652.43Mlfaw4.B7M20.4503oil1315M234.2083.5719.11M s% Tct i fUau Gsq

12、MsarMarker K d % Tot« Mean Geo 壯辽图3流式细胞仪检测 RV/EGFP对SK-N-SH细胞的转染效率Fig 3. The transfection efficiency of RV/EGFP in SK-N-SH cells was examined by flow cytometryA. The Control Group ; B. The RV/EGFP Group3讨论基因必须进入细胞才能发挥其作用，但基因是大分子物质，不能象小分子化学药物那 样可以顺利进入细胞内。基因转移载体的目的是将外源基因导入靶细胞，从而实现目的基 因在体内或体外的有效表达。

13、在医学领域基因转移载体的使用主要在两个方面，一个是进 行基因治疗，由于技术方法还在日趋完善，目前的方法还都存在一定的风险性，所以其使 用相对局限；另一方面是在医药研究领域中广泛开展，为其面向临床的应用提供可靠的资 料。目前，常用的基因转移载体包括病毒载体和非病毒载体，非病毒载体具有使用方便、 低免疫原性、一般没有毒性等优点，但由于存在转染效率低、外源基因转到宿主细胞后表 达时间短等的缺点，无法满足在治疗和研究中的需要，尤其是在慢性中枢神经系统疾病治 疗领域的要求。相比较而言，病毒载体具有较高的基因转移效率，RV载体具有能有效将外源基因整合进靶细胞基因组、长期表达外源基因以及病毒包装过程简单的特

14、点，成为基 因治疗研究中最常见的载体 5。在神经系统疾病的体外实验研究中神经元是常用的细胞模型，但由于神经元不能传代，所以每次实验都必须原代分离获得，培养步骤繁琐、培养条件要求高，而且培养系统不够 稳定，即使同一批次分离的神经元组间差异也较大，往往影响试验结果的分析和处理。人 神经母细胞瘤细胞株 SK-N-SH是已经建系并可稳定传代的拟神经细胞株6，在细胞特性方面较其他如鼠肾上腺嗜铬细胞瘤来源的PC12细胞株等更接近于神经元。因此，在体外研究中得到越来越广泛的应用 。在本实验中为了明确 RV载体对SK-N-SH细胞的转染及表达效 率，为更进一步的实验研究提供详细的资料，我们构建了整合有报告基因

15、EGFP的RV载体RV/EGFP。通过稀释病毒液感染 NIH3T3细胞，荧光显微镜计数NIH3T3表达荧光细胞的数 量，确定重组病毒液的浓度是8.3 X 10病毒颗粒/mL。为了保证在不同细胞周期的细胞都能在分裂期与RV充分作用，我们进行了 3次反复转染，在转染间期用正常培养液以恢复细 胞状态。通过流式细胞仪荧光细胞计数检测荧光表达，结果表明病毒载体有较高的转染效 率，目的基因转移并表达的效率能达到30%以上。非病毒载体基因转移如脂质体、阳离子载体、电穿孔等方法，其穿过细胞膜的效率虽然不如病毒载体依靠受体介导穿过率高，据 资料报道仍然能够达到 80%-90%，但是，进入胞浆后其进一步转录及表达

16、的效率则大大降 低，仅能达到 10%-20%。而RV进入细胞内后脱壳释放出的 RNA可在自身编码的反转录酶 的催化作用下合成cDNA，最终连接成环状双链 DNA进入细胞核整合入宿主细胞染色体基 因组进行转录和表达8，其表达效率明显增高，而且外源基因的表达长期稳定。综上所述，我们通过报告基因 EGFP的表达，证明了 RV能有效介导外源基因进入 SK-N-SH细胞并进行表达，在此基础上，我们将进一步使用RV携带其他目的基因在SK-N-SH细胞进行相关作用的研究。-5-参考文献1. Ross RA, Spengler BA, Biedler JL. Coordinate morphological

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22、Medical College of XiUni versityAbstractObjective To con struct the retroviral (RV) vector with report gene enhan ced gree n fluoresce nt protein (EGFP) and to discuss the gene tran sfer efficie ncy of RV on SK-N-SH n euroblastoma cell. MethodsBy the tech ni que of gen etic recomb in ati on, the rec

23、omb inant RV/EGFP viruses had bee nconstructed. The concentration of diluted RV virus solution was determined by counting the NIH3T3 cell with fluoresce nt expressi on. The n the RV/EGFP viruses were used to tran sfect SK-N-SH n euroblastoma cell. The tran sfected efficie ncy in SK-N-SH cell was meas