荧光定量PCR仪操作指南eppendorf

1、目录:1 安全预防法2 安装交货包装仪器的安装功能性单元Mastercycler ep realplex启动realplex 模块与热模块之间的连接Mastercycler ep realplex 与计算机之间的连接与其它部件的连接realplex 软件的安装安装主程序数据恢复开始 realplex 软件的运行3 . 操作管理者登陆登陆用户变更系统配置对使用者的管理新用户建立编辑用户删除用户用户层循环仪模块realplex系统层特性登陆出错信息用户登陆软件更新检测项目管理建立检测项目打开检测项目保存检测项目保存模板文件模板文件的使用复制检测项目检测项目的输出检测项目的输入建立文件夹删除检测项目

2、和文件夹探针管理染料管理校准背景校准颜色校准使用商业的校准工具包进行的颜色校准客户特有的染料的校准数据库管理当前数据库的自动保存当前数据库的保存输入数据库数据库的归档4 编程（检测项目的建立）建立一个新的检测项目建立板布局染料的确定参考染料的选择样本容积输入探针类型的确定背景的确定样品类型的定义标准阳性对照阴性对照未知样品复制和标准系列的自动建立定量的样品类型相对定量的样品类型多 plex 分析例子单 plex 分析的例子熔点分析中的样品类型终点测定中的样品类型+/- 检测项目中的样品类型基因辨识中的样品类型样品的复制与剪切 删除样品几个样品的归组 子检测项目的测定板布局的删除完整检测项目的板

3、布局编辑pcr 程序的建立用模板程序建立一个pcr 程序不用模板程序建立pcr 程序程序步的插入和编辑温度循环（ 1 5 步循环）保温暂停声音熔解曲线终点八、程序的复制程序的删除测量点的确定热盖设置5 操作（监测）样品的加载模块温度控制样品体积启动检测项目单个样品的选择单个样品类型的选择 循环仪状态当前运行检测项目的中断继续运行检测项目终止检测项目mastercycler ep realplex 作为 pcr 的 使用mastercycler ep realplex 作为荧光计的 使用关闭6 分析概要打开检测项目打开在运行的检测项目打开子检测项目单一检测项目的选择使样品处于不活动状态样品类型的

4、选择分析模式的选择图标缩放存储默认设置图表的保存和复制样品数据的保存和复制编辑报告模板报告的应用分析的保存调用分析土豆定量阈值确定基准线测定标准曲线分析multiplex 分析相对定量阈值的测定多 plex 分析的估算单 plex 分析的估算熔解曲线分析阈值的测定分析终点测量标准曲线分析+/- 检测项目将终点测定作为数据源的 +/- 检测项目分析模式阈值的测定pcr 数据作为数据源的 +/-assay阈值测定分析多 plex 分析基因测定阈值测定分析7 维护清洁仪器的一般方法热模块的清洁热模块的验证与校准8 故障查找一般故障在 sybr 绿色分析中发生的错误qrt pcr 过程中发生的错误登陆

5、新用户的建立创建一个检测项目检测项目的保存执行检测项目概述板布局pcr 程序开始检测项目当前运行检测项目的中断继续运行检测项目退出检测项目分析10 技术数据功能性单元Mastercycler ep realplex1图1：关闭的realplex 模块前面观1 realplex 模块2状态显示3密封压板（锁住状态）4控制面板的挂钩（Mastercycler ep realplex不需要）5热模块图2：打开的realplex 模块前面观Figure 由国陶1 Seal2 reaifi3 Th吊1密封压板（开启状态）2 realplex 模块3热模块放入试验样本后，向前拉动realplex 模块，覆

6、盖住插入的试管。然后用压板密封，程序开始启动。注意在把密封压板归位时小心不要弄伤手指。当realplex模块开启时，不要触碰盖子下端以防被灼伤。开始realplex 软件的运行打开mastercycler ep realplex的开关，等待位于开关上部的LED灯将变为绿色。现在您可以开始运行realplex 软件了。您也可以在mastercycler ep realplex 处于关断状态下运行realplex 软件，甚至在不接任 何硬件的状态下运行该软件。第二种情况下，软件将会提示一条错误信息，可以忽略该信息继续运行软件。注意：当使用realplex 软件时，不要运行其它会占用计算机大部分内存

7、的软件（如：CD创建器或者媒体播放器等）！决不可以使计算机工作在电池供电模式！调整计算机供电电源的设定值以保证在程序运行过程中，计算机不会进入待机状态。3 .操作管理者登陆当realplex 软件第一次被打开时，将会显示如图所示的一个登陆对话框，提示软件管理者为Eppendorf命名并输入登陆密码。这项是仪器的出厂设置，如有需要用户可以在UserAdministrator对话框中对此项进行修改（详细情况请查阅节）。此后软件再次被打开时，无论软件管理者还是其他的软件使用者，都必须建立一个用户才能登陆使用realplex软件。登陆在打开程序时，Mastercycler ep realplex用户都

8、必须先登陆才能进一步使用软件。所有用户名都列在选取框中。我们要做的就是选出自己的用户名并输入相应密码。新用户由软件管理者建立。（请参阅节）如果登陆密码输入错误，则会显示登陆失败（ login failed ）。点击OK键确认后，重新进入登陆程序。如果点击Cancel键，则显示主屏幕（情参阅节）。但是此时所有的功能键都会处于无效状态。为进入工作状态，使用者必须再次打开登陆对话框（情参阅节）完成登陆手续。Mastercycler ep realplex注意：登陆以后，用户可以对自己的文件夹和分析程序进行读或者写的操作，与仪器连接后可以执行其他的实验操作。而对软件其他用户的文可以将其复件夹和分析程序

9、只有读的权限。如果想要执行或编辑其他用户的分析程序的话, 制到自己的文件夹中。用户变更当已有其他使用者登陆时，可以按照以下方法登陆系统:通过点击该图标以退出登陆。哥如果选择登陆图标，User login对话框将被弹出，使用者可以按照节中描述的登陆步骤进行登陆。以上两种功能也可以通过File菜单来实现。软件在同一时刻仅允许一名用户登陆，新用户的登陆将自动使原来的使用者退出系统。Current User: Beate当前登陆用户将被显示在屏幕下方的状态栏内O登陆后，主屏幕显示为Administror 或者User。主屏幕包括向导区，工作区和状态区。如果在左边的向导栏内选定某一程序函数时，该程序函数

10、则会显示在工作区内，而状态栏中将显示热模块的状态信息和当前使用者的用户信息。1菜单栏2工具栏3向导区 4工作区 5状态栏通过选项show/hide navigator ,向导区可以被显示或者隐藏。这一操作也可以通过 setup菜单实现。注意：所有的对程序各个功能的操作以及对系统配置的操作，都可以通过工具栏或者菜单栏实现。选择性的操作还可以通过点击鼠标右键来实现。系统配置在setup 菜单中选择 system configuration 项，贝U在菜单栏中显示realplex system configuration 对话框。其中对话框左边列出了所有的使用者名单以及处于连接状态的模块名单，此外还

11、有系统设置及其功能的结点选项。在向导栏内不同的层次显示为不同的符号。当用光标选中某个结点时，从属文件夹将变为可见的，再选一次则可关闭该结点。如果某层或其从属文件夹被选中，将在对话框的右边显示出相应的窗口内容。. 即川吟§ BunQ 。3n口力& KuiusJi OhOg REiKrtAJt.fi对使用者的管理当选中User项，User Administration图表显示在对话框右边，列出所有的用户名单。软件管理者登陆系统以后，可以使用该对话框进行建立新用户，编辑和删除已建立的用户的操作。循环仪 在cycler结点处，可以得到已连接的循环仪的信息。设备特性被列在 proper

12、ties图表下。此外相应硬件的资料以及最后登陆的用户名，还有最后运行的程序都会在此栏下显示出来。在incubate 和lid图表下，可以调整热模块和加热盖的温度值。具体做法为首先在newtemperature 一栏中填入所需的温度值，然后选择incubate 复选框以确认。如停止调温，则释放incubate复选框。PCRS序文档信息在 protocol图表下显示。首先给出了启动PCRS序的登陆用户白M言息以及该PCR程序的程序名和启动时间。接下来是相关的程序特性信息和热盖设置。除此之外，程序的运行各步骤也会在此显示出来。如果选中这个功能键，则原始记录将被作为txt文件保存。如果选中这个功能键，

13、则原始记录将被与计算机相连的打印机打印出来。在Cycler结点处双击鼠标，System结点就会显示出来，其中包含有模块的特性信息。特性：properties栏中显示出模块的型号以及热模块的序列号，同时热模块被最后验定和校定的信息也会显示出来。Sensors :显示当前传感器的温度值。温度验定：通过温度传感器对仪器的温度值进行测量，属于仪器温度验定系统的一部分（请详见命令信息）。该过程在温度验定系统的操作手册中有具体描述。温度校定：借助于温度传感器，对仪器的温度值进行的调整操作。其性能在温度验定系统的操作手册中有具体描述。realplex 模块 在realplex module 结点下将显示re

14、alplex 模块的特定的系统信息。rcalptcx System canflgurdlicnQ Lpptdcr-糊U全旧i ： 石I、则仙3Rpant”方匕n。：丘品rd| 5 WkT既I干以匚月+ ricfdlplvic HutiileDtrlt Vtra unIR眦' 4Sw-al INo galpN 门odd申00059rjo LED w:sfijl Na M -HkWR3"_8i*nim3Said No PMT 喃际i柒英国第Q7D5如洲L PMT1£«j| ha PMT 2RDQXE 匕FoTOr&VfaignNl".213t

15、-K of ln Ulmton八用席;值IQ；峙Chnnd A匕 2 UhmB&Lln mna.Channel 358frnKSntrna.：Lr»niFMT VdiK*r Cm 4D-iirenl FMT VdJage, Chn BF 1631 u °Covt-ii 5t削蜕 irksagl BLAJdKE口ieg 匚 kdCartelor除了显示mastercycler ep realplex仪器的版本信息和软件的版本信息以外，其他装配件的序列号也会在此显示出来。同时还有滤波器设备资料和光电倍增器所选电压值。Realplexmodule还会指明设置realple

16、x 模块的CAN总线地址以及热模块和realplex 模块之间是否是通过CAN总线电缆相连的。Cover state 一栏中显示出加热盖的当前位置。在realplex module结点处双击鼠标左键打开下层各结点。Module log 文件目录下记录了程序运行中出现的所有出错信息。这一图表中的出错信息可以通过选中save功能键以txt格式保存下来，或者选中print功能键通过已连接的打印机打印出来。H-急 E 耳itridb，m钳！ LIg0口£小匕 亡自MaEperdoil1Jsor"曲 Hunt chi皿 Rye 电 * 凡twr;a* iB41TTI引Mwult Li

17、j:Syas-nT力庭FuuEven(/,p 29/200515:560x101 DEnor KFUGJFluofloscw由川阳团）05通步前1时0101 DFl nr riFMFluM r1J2Jt>F»uurertuser: Ejceridirf检测项目管理在工具栏中可以实现以下的检测项目的管理功能：口学国浮%12345 61新检测项目2打开检测项目3保存检测项目4打印报告5将文件输入当前的选中部分6将当前的选中部分输出注意：以上提及的各个功能还可以通过file 菜单，或者把鼠标放在向导栏中点击右键来实现。建立检测项目当选中new assay图标时，将出现一个空白的板块，

18、标准的 pcr程序将在工作区内被装载。打开检测项目当选中open assay图标以后，将弹出检测项目对话框:如果一个用户或者文件夹处于选中状态时。除了文本名、建立时间和更新时间会在assays面板上显示出来以外，所有保存其中的检测项目也都会在右边显示出来。而且还会提示出各文本的状态。目标有setup的文本代表从没被打开过。打开文本时，文本将被装载在assay setup 和analysis 中，而且在analysis 中没有数据资料。目标有template的文本可以作为建立新文本的模板文本使用。更多相关信息请详见和节的关于模板文本的建立日期和使用的介绍。青标有complete的文本代表数据获得

19、已经发生过的文本。如果这样的文本被打开，数据将会显示在analysis下。并且除非有其它文本当前正在被运行的情况下，该文本才会显示 在assay setup 中。详见节中的介绍。当某个文本被选中，该文本中保存的所有分析数据都将被显示在下方的analysis 窗 口中。数据建立和执行这些分析的用户名都会被在这里列出来。闻因为断电或者系统发生错误等原因造成失败的文本都带有这个aborted的标志。如果在发生失败前获得了足够多的数据，那么该文本还是可以被拿来分析的。保存检测项目检测项目可以由登陆用户在他的结点下或者文件夹中执行保存操作。只有登陆用户才能执行对这些程序文件的编辑操作。而其他使用者只能对

20、这些文件执行读或者复制的操作。O当 save assay的图标被选中后，当前的检测项目被执行保存操作。当要把一个检测项目保存在某目标文件夹下时，可以选中file 菜单下的save as功能键,打开相关对话框来实现。输入检测项目名后，文本通过复选框assay type被选中，点击ok以确认。保存模板文件当一个检测项目要在被创建以后多次重复使用时，该文件将被保存为模板文件。具体方法为在保存文件的过程时，复选框中选择template栏。模板文件的使用当创建简单的新检测项目时可以用到模板文件。具体方法：模板文件在assay setup通过功能键open assay中被装载，以检测项目的形式，命名后保存

21、在用户结点下。复制检测项目用户可以复制其它用户的文本到自己的文件夹，对这些文本与模板进行启动和编辑。具体方法为：在assay对话框中使用open assay选中和打开其他用户文件夹下相关的检测项目，然后通过save as将文本复制到自己的结点下（请查阅节） 。这时用户就可以在连接 mastercycler ep realplex 以后，直接启动和执行复制的检测项目了。检测项目的输出检测项目的输入输出功能用于几个工作站之间的文本交换。在此检测项目与板布局、PCRg序和被测数据一同被输入输出。|lfe 图标export assay to file 用来以ASY格式保存当前的检测项目到另一个工作站上

22、 的计算机上以便对文本做更多的处理。在窗口的靠上一栏中选出检测项目的保存位置，然后输入文本的名字，并在刊e type 一栏中选择 realplex exchange (*.asp )。检测项目的输入当选中图标 import assay from file时，一个格式为 ASY的检测项目就会被装载到一个空白的文本中。当输入一个检测项目时，必须在窗口的靠上一栏内选中一个相关的保存位置，文件类型为realplex exchange (*.asp )。建立文件夹登陆用户可以在本人用户结点下建立文件夹，相关的文件和文本都在这个文件夹中保存，以 方便日后的调用。根据如下的步骤建立文件夹:通过图标open

23、assay打开检测项目的对话框。选中本人用户结点后，通过功能键new来添加一个新的文件夹。Rename可以首先通过选中文件夹，然后再点击功能键rename来重新命名。然后检测项目就可以在建立的文件夹中进行复制和创建等操作了。（请查阅和节）删除检测项目和文件夹通过图标open assay,用户可以在检测项目对话框中，点击功能键delete来删除选中的检测项目，最后点ok确认删除操作。同样的删除操作可以用来删除文件夹。Delete选中一个检测项目或者文件夹后，可以通过点击功能键delete ,和确认 yes来删除该检测项目或者文件夹。染料管理选中dyes图标后，将会弹出相应对话框。这个对话框用于实

24、现对染料的管理。在荧光测量中，染料是必须被适当设定的。 相应染料的最大发射波长对于用户选择适当滤光片（如FAM520nml一号滤光片520+/-5 nm ）滤光片是非常重要的。请向各自的生产商咨询所需染料的最大放射量。注意：在执行颜色校准（请查阅节）前，必须先定义相应的染料。染料名称染料最大的发射波长，单位为纳米（ nm）染料检测通道。基于特定的染料波长有程序预先自动设定。具体染料校准时的光电倍增器的敏感度。包含有四位数码，用来为四个滤光片中的每一个设定相应数值（1代表低敏感度，9代表高敏感度）。该数码由软件预先设置。Calbrat* by最后一次执行染料校准的用户Calibration da

25、te最后一次校准时间。New Dy4在点击此键以后所显示的对话框中，新染料的所有数据都可以在这里输入进 来。这个对话框用来输入新染料的名称和检测新染料的滤光片。滤光片必须与新染料的发射波长相匹配。Edit/View. I当前染料的所有数据都可以在点击此键以后显示的对话框中修改。按 ok以确认。加江柜点击此键后，选择yes确认删除的染料。注意：如果染料的滤光片发生改变的话，将会失去染料的校准资料。校准在使用mastercycler ep realplex做荧光试验时，需要事先进行背景和颜色校准。校准应和随后的试验处于相同的温度下。注意：为保证密封盖上没有液体，溶液内没有空气泡，校准前应首先对校准

26、板进行离心操作。一定要确保没有液体蒸发，否则使用新的校准板。在校准前，要保证仪器已经启动了至少15分钟。注意：软件会自动确定每个染料和滤光片所需的光电倍增器敏感度。所以用户无需有任何输入。背景校准必须要在颜色校准之前执行。背景校准选中菜单栏setup后，就会弹出background calibration对话框，列出所有保存的背景校准。该列表还列出了校准时间和执行校准的用户名。除此之外还显示了背景校准的状态。Plate使用的板名称Default作为默认设置的背景校准，带有十字标记。SensrtivityCali bration date执行背景校准的日期光电倍增器的敏感度在染料校准过程中以四位

27、数码的形式被确定下来。四个 滤光片中，每个滤光片都对应确定一个数码（1代表低敏感度，9代表高敏感度）。这四个数 码由软件预先设定。Calbrated by二执行背景校准的用户一个新的背景校准过程会在点击该栏后出现的对话框中进行。一 对话框new被打开后，输入背景板的名称。一在右边的对话框的incubation 栏中，输入模块和盖子的温度值。模块温度的缺省值为60摄氏度，盖子温度的缺省值为105摄氏度。一 插入背景板以后，单击功能键calibrate 开始执行校准，单击 ok键确认操作。一 在加热和第一次读值完成后，软件会提示翻转背景板，请按照软件的提示操作，翻转背景板，单击ok确认操作。如果背

28、景校准成功完成的话，背景板会显示出96个绿色位置的板布局。单击ok确认以关闭“校准成功完成”提示框。如果背景板在校准过程中的某些位置校准失败时，单击 cancel来放弃校准数据。在这种情况下，前次的校准数据将被用来使用。选中proceed键时，背景校准数据在任何情况下都会Vie喇Run被排除。在显示的对话框内，可以改变当前背景校准的所有的数据，然后校准过程被重复进行。前次的背景校准的数据将被覆盖。Default当选中功能键default时，对于所有的检测项目来说，校准都为默认设置。此时在背景校准列表中，将显示一个十字标志。Delete点击yes来确认对背景校准的删除。热模块的清洁请背景校准失败

29、的另一个原因可能是热模块内一些容器内的荧光污染造成的。详见节。数据库管理所有的数据、设置值、用户结构都自动保存在数据库中，推荐用户定期为数据库建立备份。注意：不要混淆不同器皿的数据库。Database tool软件可以用来管理数据库。Database Tool双击图标 database tool 后，显示出 realplex database administration对话框。上面的selected database面板显示出当前数据库和其当前状态。Datebases and Archives图表显示了所有可用数据库的列表。共有两种形式的数据库： 实际使用的数据库，其中的数据都是当前存储的。

30、数据库的名字由数据和数据库开始使用的日期组成。在 selected database面板中，数据库被打开后，显示为绿色。一档案文件数据库都处于只读状态，储存以前的数据。这种数据库由档案和建立数据库的日期组成。在selected database面板中，随着数据库的被关闭，数据库显示为红色。如果在列出的数据库中选中其中一个时，这个数据库将显示在 selected databases面板中,并且与realplex软件连接起来。如果选中功能start realplex的话，realplex软件会被直接打开。当前数据库的自动保存打开realplex软件后，一个备份将以一个正式基本形式自动在目录C:pr

31、ogramseppendorfrealplexsecurity中被保存。关于自动保存的一些设置可以在图表 configuration中进行。注意：只有管理者用户才有权力使用图表configuration设置自动保存。注意：当建立的自动备份超过十个时，最先建立的那个备份将被自动删除。因此，推荐定期建立备份。这些备份应该保存在磁板或者服务器上。当前数据库的保存当前数据库副本的保存可以在图表backup database中进行。这一备份包含所有的数据和设定，其中包括检测项目、模板文件、校准数据和用户结构。面板显示了哪一个数据库要进行备份和在图表databases中选中的数据库。通常来讲，备份都是针对

32、数据库和档案文件操作的。备份的名称由软件自动给出。根据源文件，名称可以是数据备份或者档案备份和建立数据。 I当选中图标 browse时，对话框 set backup file name就会显示出来。当前的数据库将被赋予名称，点击功能键save,将该数据库以gbk形式放置在backup面板上提示的目录下。注意：为了 realplex 软件可以成功识别数据库，需要根据源文件，在每个备份前加上Start Backupbackup_data 或者 backup_archive 。下，建立一个备份文件。当点击 start backup 功能键时，在目录C:programseppendorfrealple

33、xbackup该过程被记录在图表log中。备份被自动保存在目录C:programseppendorfrealplexbackup 下。该目录可以在图表configuration中被修改。如果计算机是一个网络中的其中一台的话，建议将此目录设置在服务器的目录之下。注意：只有管理者用户有权进入图表configurations（详见章内容）输入数据库在realplex软件中，如果要将原来的数据库的备份激活，当前数据库必须被替换成一个备份文件，具体做法为首先在图表restore database中选中备份文件。点击图标 browse后，显示 open backup files对话框。Start Rest

34、ore点击功能键open后，将在图表restore database 中加载以gbk形式保存的数据库。点击功能键 start restore 以后，数据库从目录 C:programsrealplexbackup中被加载进来。该过程将被记录在图表log中。注意：包含有检测项目，设定值，校准数据和用户结构的所有数据会被该数据覆盖。建议在此之前先建立一个当前数据库的备份。为了作为实际使用的主数据库， 使用一个已保存的数 据库时，要确保所有的校准数据还是有效的。注意：也可以对一个档案文件备份的数据库进行恢复操作。在备份在图表restore database中被加载后，激活复选框 create main

35、 database from archive执行恢复操作。建议在此之前对当前数据库建立一个备份。所有具有管理者权限的用户都可以管理数据库。在组合框内选中自己的用户名后，输入用户密码，并按ok确认（请查阅节）。用于realplex 软件的密码在此同样是有效的。数据库的归档当数据库大小超过大约250MB时，打开realplex 软件时，用户将被提示对数据库进行归档操作。归档后，用户可以以一个新的数据库继续工作，该数据库中包含有所有有关模板文件的设定、校准数据和用户结构内容。只有具有管理者权限的用户可以进行数据库管理。在组合框中选中用户名后，输入密码并按ok确认。用于realplex 软件中的密码在

36、此同样有效。用户登陆后，可以打开create archive 图表。面板中显示了将要被进行归档操作的数据库，在表databases中选中该数据库。归档名称有软件自动建立，包含有 backup_archive和建立日期。甄A而而ng选中功能键start archiving后，在目录c:proguammeeppendorfrealplexbackup下建立一个档案文件。该过程将被记录在表10g中。4编程（检测项目的建立）mastercycler ep realplex软件基本上包含有两个模块：assay setup 和 analysis 。模块assay setup被分为如下三个子项目：plate

37、 layout （板布局），pcr程序和监测系统。前边两个子项目用于检测项目的编辑，而在监测系统之下，运行的检测项目可以被在线的监测。模块analysis将在本书第六部分中被具体阐述。注意：各自使用不同检测项目的两个模块可以并行操作。即当其中一个检测项目正在运行时，另一个已完成检测项目的分析可以同时进行。（请查阅第6章）建立一个新的检测项目新的检测项目可以通过点击file 菜单下的new assay项建立。在左边窗口的向导栏中，初次显示的新建检测项目没有名字，带有从属项板布局(plate layout ), pcr程序(pcrprogram )和监模U ( monitoring )。如果从属项

38、其中的一项被选中后，新建检测项目显示在右边的工作区内。另外，通过菜单项 command助能键，不同的模块也可以被加载到工作区。回日8电池Setup OILayout-M PCR Program捶 Analysis - <->打开软件后，作为默认设置，在工作区内存在一个可用的空白的板布局。建立板布局为建立一个板布局， 选中向导栏左边的 plate layout。可以看到右边的 pcr板的96个位置。为了对其进行编辑，首先要确定被检测的染料。为了方便用户，后续操作的各条指令显示在与工作区相邻的右下方的hints区内。为建立板布局，如下的工具栏内的各个功能都是有效的。区|电川电七|芯愈d

39、叩眼虐123456789 10111清理板2未知3标准4阳性对照5阴性对照6删除样本7组成复制组8拆分复制组9建立子检测项目11板布局的编辑模式注意：另外，以上各个功能还可以通过菜单项目plate layout或者鼠标右键来实现。染料的确定在此，在带有相关滤光片的filter +dyes面板上，染料通过组合框被选中。如果所需染料不包含在选项中，必须首先将其添加在菜单栏setup （请查阅节）下的列表和校准该染料的仪器中。（请查阅节）。川口匕珀rrrfrr三削31用心白IDu£5K nanejQmplWol JlPiubcBadkgrcunt |如果realplex 软件与master

40、cycler ep realplex2 相连，那么580nm滤光片和605nm滤光 片不会显示在面板上。参考染料的选择参考染料可以在reference dye面板中通过组合框选择。但前提条件是该染料的颜色校准已经执行过了，而且该染料已经在filter +dyes中被选好了。没有染料被默认选中。样本体积输入在工作区面板白右上端的 sample vol中输入样本的体积。虽然这项输入并不是必须的，但 是为了检测项目文件编制的完整，建议完成该项输入。探针类型的确定在板布局面板的右上端，通过组合框选择探针类型。如果所需探针类型不包含在选项内，必须首先在setup下添加其到probes列表中。（请查阅）。

41、注意：探针类型的定义不是一定必须的，因为它对pcr程序中的测量点没有什么影响。但是为了检测项目文件编制的完整，建议完成该项输入。背景的确定在板布局面板的右上端，通过组合框选择背景的相关板类型。这也是执行检测项目所需的板类型。如果所需的板类型不包含在选项内，必须首先执行该背景的校准。样品类型的定义在板布局中选中一个或更多位置，在被打开的相关对话框中编辑，并在随后出现的工具栏中的，通过图标选择不同的样品类型。以上板布局编辑功能也可以通过鼠标右键或者菜单plate layout项实现。当各项输入完成后，带有样品类型、样品名称和sample表中的位置等数据的样品就会显示在左边窗口内。在右边窗口的sam

42、ple info 中，列出了板布局选择样品的各数据。Sample InfoPositionA1Sample Name Sample 1TypeUnknownTaiget 1 DpeActin5YBRTargetsDyeReference Dye ROX标准当图标standard被选中后，出现相关的对话框。1在板布局中样品的位置2样品名称3目标基因选项的复选框4目标基因名称5检测目标基因使用的染料6标准浓度单元7标准浓度8内部阳性对照（ipc ）选项的复选框9内部阳性对照（ipc ）染料选项的组合框10样品类型符号在这里，各数据和待检测目标基因都以标准名称输入。同时，在相关区域内，必须明确用量和

43、浓度的标准。指数值的标准输入， 例如：1E&单位copies以及用量=1都是默认设定的。可以通过auto series功能来建立标准系列。（请查阅）注意：在这个对话框里可以进行编辑的目标基因的数量取决于在板布局中选择的染料的数 量。阳性对照.口 选中position control 图标以后，将出现如下的对话框。除了对照的名称和目标基因的数据以外，在此也可以定义基因识别( gene identification )分析模式下，作为等位基因的阳性对照。首先需要完成作为等位基因的阳性对照的编辑。在analysis下进行随后的识别时，对话框里每个等位基因都被自动分配一个颜色。也可以在amou

44、nt栏内输入数值。但这在随后的分析中不是绝对必要的。阴性对照口当选中negative control图标后，相关对话框被打开。在此对话框中只输入阴性对照的名称和目标基因数据。未知样品当unknown图标被选中后，如下的对话框被打开。除了未知样品名称和目标基因数据以外，通过功能键auto series还可以在此编辑复制。(请查阅节)在对话框的下端包括use of target gene(s) as 面板和 relative quantification/geneexpression 面板：use of target gene(s) as ：可以通过一个内部阳性对照或者选定相关功能键作为持家基因设

45、定目标基因，然后用组合框确定各自的染料。分析中由内部阳性对照或者作为持家基因设定的基因被加亮为黄色。Relative quantification/gene expression：在此目标基因被定义为relative quantification/gene expression分析模式下的校准器。持家基因的对于 monoplex 分析，通过组合框 well with housekeeping gene(monoplexing)孔可以与样品关联。复制和标准系列的自动建立 当样品类型为标准(standard )和未知(unknown)时，可以自动建立复制。在编辑标准时,也可以自动建立标准系列。首先

46、在要建立标准系列和复制的板布局内至少选择两个位置。Aulo Series ->为化简标准系列和复制的建立，使用new standard 对话框。其中包含有auto series 项。注意：只有当板布局中超过一个位置被选中后，该功能才能被激活。Autormatic SeriesNumber 5 sefcected(口他:6Number of refected columns： 3Order| 日总tending 二)ReplcstesNumber ofReplicatesDefine Replicate Pattern Aignment | hwi?ontl三 Drection | by

47、Rows .Dilution FsgIqfDilution StepsReviewamountiPrevtev?扩充对话框指明了板布局中被选中的位置，被分为复制和稀释两个区域。复制:在编辑框中输入复制的数量，另外，该项也可以用来定义板内复制布置形成基准的形式。相关复制可以布置成水平相邻或者垂直相邻的形式。以不同的方向，不同的复制可以相邻的排成行或者列。为说明的目的，形式显示在窗口preview中。稀释:使用编辑框来明确稀释元素和稀释步骤数。通过组合框order可以明确采用升序还是降序。在preview calculated amounts 栏中，通过组合框选中一个染料，根据在目标基因中定义的浓

48、度初始值，显示浓度最终值。注意：这个区域在unknowns扩充对话框中处于不活动状态。点击ok确认该对话框后，在被选区域内建立起与参数数量相同的组数。当用未知样品建立复制时，整个被选区域被填满。样品名称和所有相关的数据都被自动分配。对应标准系列的单一标准的浓度数据也被自动显示在板布局中。定量的样品类型为了定量样品中的初始核酸，要用一个未知的初始核酸量从样品中建立起一个标准曲线。为了这样的目的，首先编辑板布局中的标准，然后编辑未知样品。阴性对照也要编辑。编制标准系列的例子：目标是建立一个10- 100000拷贝的三重复制子的标准系列，复制布置为彼此相邻以行排列。拷贝的最高数量放置在位置 A1C1

49、上，稀释系列采用降序，水平列，每步稀释10倍。 在板布局中选择区域 A1E3 打开standard 对话框，其中包含附加 auto series 项。一输入参数点击ok确认输入。Npw SranriardA1一即口目：。问的圜 lelUrtl口讨iAlllULTt 1JrulP |GaPOHFAM100000Ccpe$dTerget 2二?:=二Amatfit 2Jn*211弱口或3r匚#3IAmouTt 3IJnt 3zJr|iIdIccgct 4Arnaud 4JnUr|rIJ 1Automatic SenesNurtoei Mimw 5Hurbei of 5日cd cdunra: 9"Jurrbci ofn-q三eplE 聆mOMonFactar |1D5t?irie ReiilLdiit! PJtsir.DikAan Step3Prefer | desc?ndina jJPreview cdluuhl?J aiuj'ils forCse I翔HiTAliormerr |hwzonta 二J Dir>cbcn | by C