酶工程山东师范大学ppt课件

1、第二章第二章 酶的生物合成与发酵消费酶的生物合成与发酵消费 提取分别法 微生物细胞发酵产酶 酶的消费方法 生物合成法 植物细胞发酵产酶 化学合成法 动物细胞发酵产酶 第一节第一节 酶生物合成及调理酶生物合成及调理一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遗传信息传送的中心法那么遗传信息传送的中心法那么转转录录传传送送给给RNA，再再由由RNA 蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA 一一RNARNA的生物合成的生物合成-转录转录(transcription)(transcription) 定义定义 以以DNADNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在为模板，以核苷三磷酸为底物，

2、在RNARNA聚合酶转录酶的作用下，生成聚合酶转录酶的作用下，生成RNARNA分子分子的过程。的过程。. .转录模板转录模板启动子启动子promotor) 终止子终止子(terminator)模板链模板链template strand反意义链反意义链(antisense strand)编码链编码链 (coding strand)有意义链有意义链(sense strand)5533反意义链反意义链: :指点转录作用的一条指点转录作用的一条DNADNA链链有意义链有意义链: :无转录功能的一条无转录功能的一条DNADNA链链. .T C G A G T A CA G C T C A T GC G

3、A G U A CG C A URNA聚合酶聚合酶有意义链有意义链反意义链反意义链RNAPPi5 55 53 3GTPUTPCTPATPUTPRNA在在DNA模板上的生物合成模板上的生物合成3 33 35 5RNA的转录过程的转录过程(三步三步)1.1.起始起始2.2.延伸延伸3.3.终止终止 原核生物的RNA聚合酶(DDRP)E. coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体 2 核心酶（core enzyme）全酶（holoenzyme）起始因子RNARNA合成过程合成过程起始起始双链双链DNA部分解开部分解开磷酸二酯磷酸二酯键构成键构成终止阶段终止阶段解链区到达解链区到达基因终点基因终

4、点延伸阶段延伸阶段53 RNA 启动子启动子promotor) 终止子终止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 35 3553 分开分开RNA链的延伸图解链的延伸图解35RNA-DNA杂交螺旋杂交螺旋聚合酶的挪动方向聚合酶的挪动方向新生新生RNA复链复链解链解链有义链有义链模板链反义链模板链反义链延伸部位延伸部位 定义定义 以以mRNAmRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上经过各种体上经过各种tRNAtRNA、酶和辅助因子的作用，合、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。成多肽链的过程。酪酪5 55 53 3AUGGUU UAC ACA酪氨酰酪

5、氨酰- tRNA反密码反密码mRNA密码与反密码的碱基配对密码与反密码的碱基配对AUG ACA5 5蛋蛋苏苏UGUGUU3 3受受 位位(A位位)给给 位位(P位位)大亚基大亚基小亚基小亚基 蛋白质的合成过程蛋白质的合成过程 大肠杆菌大肠杆菌v 氨基酸的活化氨基酸的活化v 肽链合成的起始肽链合成的起始v 肽链的延伸肽链的延伸v 肽链合成的终止与释放肽链合成的终止与释放反响式：反响式：AA + tRNA + ATPAA + tRNA + ATP氨酰氨酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶氨酰氨酰-tRNA+AMP+PPi -tRNA+AMP+PPi 对于对于E.coliE.coli而言，肽链合成时的

6、第一而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸fMetfMet。1 1、起始阶段、起始阶段2 2、延伸阶段、延伸阶段3 3、终止阶段、终止阶段肽链合成的起始阶段肽链合成的起始阶段1.mRNA1.mRNA与小亚基结合：构成与小亚基结合：构成30S-mRNA-IF330S-mRNA-IF3复复合物合物2.AUG2.AUG与蛋氨酰与蛋氨酰-tRNA-tRNA结合：结合： 30S-mRNA-IF330S-mRNA-IF3 fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA fMet-tRNA正好位于正好位于mRNAmRNA的起始密码子

7、上的起始密码子上AUGAUG。3.3.大小亚基结合大小亚基结合IF130S30S起始复合物起始复合物AUG ACA5 53 3AUG ACA5 53 3UACUACAUG ACA5 53 3小亚基小亚基mRNA蛋氨酰蛋氨酰tRNA GTP大亚基大亚基GDP+Pi受位受位给位给位蛋蛋蛋蛋肽链合成的起始阶段肽链合成的起始阶段肽链合成的延伸阶段肽链合成的延伸阶段1.1.进位进位: :氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA进入受位进入受位; ;2.2.转肽转肽: :构成肽键构成肽键, ,在转肽酶作用下在转肽酶作用下, ,给给位与位与 受位结合受位结合; ;3.3.移位移位: :核蛋白体向核蛋白体向3 3端挪

8、动一个密码子端挪动一个密码子的的 位置位置, ,空出受位空出受位, ,不断地进位、不断地进位、转肽、转肽、 移位移位, ,使肽链延伸。使肽链延伸。AUG ACA5 53 3UAC蛋蛋苏苏UGUAUG ACA5 5UAC蛋蛋苏苏UGUGUUAUG ACA5 5UAC蛋蛋苏苏UGUGUUAUG ACA5 5蛋蛋苏苏UGUGUU3 33 33 3GTP GDP+PiGDP+PiGTP起始复合体起始复合体进位进位转肽转肽移位移位Mg+K+肽链合成的终止阶段肽链合成的终止阶段1.1.出现终止密码并与终止因子结合出现终止密码并与终止因子结合; ;2.2.肽键水解肽键水解, ,多肽释放多肽释放; ;3.tR

9、NA,mRNA,3.tRNA,mRNA,大小亚基解离大小亚基解离. . AUG UAA5 5UACAUG UAA5 5UAC3 33 3终终终终AUG UAA5 5UAC3 3终终5 53 3UAC终终肽链肽链定义：经过调理酶合成的量来控制定义：经过调理酶合成的量来控制微生物代谢速度的调理机制，是在微生物代谢速度的调理机制，是在基因转录程度上进展的。基因转录程度上进展的。意义：经过阻止酶的过量合成，节意义：经过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。约生物合成的原料和能量。 支配子基因表达的协同单位支配子支配子构造基因编码蛋白质构造基因编码蛋白质, structural gene, S控制

10、部位控制部位支配基因支配基因operator gene, O启动子启动子promotor gene, P基因支配子调理系统表示图基因支配子调理系统表示图 调理基因 启动基因 支配基因 构造基因 DNA 转录 - RNA聚合酶 + 转录 翻译 mRNA 翻译 阻遏蛋白 蛋白质 诱导剂 控制区控制区 信息区信息区支配子支配子 调理基因(regulator gene)： 可产生一种组成型调理蛋白(regulatory protein) 一种变构蛋白，经过与效应物(effector) 包括诱导物和辅阻遏物的特异结合而发生变构作用，从而改动它与支配基因的结合力。 调理基因常位于调控区的上游。RPOSD

11、N AC RP-cA M P复 合 物C RP+cA M P cAMP-CRP复合物的作用表示图 启动基因启动基因promotor genepromotor gene启动子：启动子： 有两个位点：有两个位点： 1 1RNARNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点2 2cAMP-CAPcAMP-CAP的结合位点。的结合位点。CAPCAP：分解代谢产物基因活化蛋白：分解代谢产物基因活化蛋白catabolite catabolite gene activator proteingene activator protein，又称环腺苷酸受，又称环腺苷酸受体蛋白体蛋白(cAMP receptor prot

12、ein(cAMP receptor protein，CRPCRP。 只需只需cAMP-CRPcAMP-CRP复合物结合到启动子的位点复合物结合到启动子的位点上，上，RNARNA聚合酶才干结合到其在启动子的位点上，聚合酶才干结合到其在启动子的位点上，酶的合成才干开场。酶的合成才干开场。 支配基因支配基因Operater geneOperater gene: : 位于启动基因和构造基因之间的一位于启动基因和构造基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调理基因产段碱基顺序，能特异性地与调理基因产生的变构蛋白结合，支配酶合成的时机生的变构蛋白结合，支配酶合成的时机与速度。与速度。构造基因构造基因Struc

13、tural geneStructural gene: : 决议某一多肽的决议某一多肽的DNADNA模板，与酶有模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为录为mRNAmRNA，再翻译为蛋白质。，再翻译为蛋白质。( (二二) ) 酶合成调理的类型酶合成调理的类型 1.1.诱导诱导 (induction) (induction) 组成酶：细胞固有的酶类。组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为顺应外来底物或诱导酶：是细胞为顺应外来底物或其构造类似其构造类似 物而暂时合成的一类酶。物而暂时合成的一类酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression) (repr

14、ession) 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏(catabolite (catabolite repression)repression) 反响阻遏反响阻遏(feedback repression)(feedback repression)3阐明菌体生物合成的经济原那么：需求时才合成。调理调理基因基因支配支配基因基因乳糖构造基因乳糖构造基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白有活性有活性基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调理调理基因基因支配支配基因基因乳糖构造基因乳糖构造基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白无活性无活性

15、 基基 因因 表表达达mRNAA、乳糖支配子的构造、乳糖支配子的构造B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白有活性有活性诱导诱导 2. 2.末端产物阻遏末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。起的阻遏。 酶合成阻遏的景象：酶合成阻遏的景象： 实验：实验： 1 1大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培育基上时，的培育基上时， 检测到细胞内有色氨检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；酸合成酶的存在； 2 2在上述培育基中参与色氨酸，检在上述培育基中参与色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，测发现细胞内色氨酸

16、合成酶的活性降低，直至消逝。直至消逝。 3 3阐明色氨酸的存在阻止了色氨酸阐明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，表达了菌体生长的经济合成酶的合成，表达了菌体生长的经济原那么原那么: :不需求就不合成。不需求就不合成。 色氨酸支配子色氨酸支配子酶的阻遏酶的阻遏调理基因调理基因支配基因支配基因构造基因构造基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与支配基因结合，阻遏蛋白不能与支配基因结合，构造基因表达构造基因表达调理基因调理基因支配基因支配基因构造基因构造基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与支配基因结合，构造与支配基因结合，构

17、造基基因不能表达因不能表达酶酶的的诱诱导导和和阻阻遏遏支支配配子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂支配基因支配基因启动基因启动基因调理基因调理基因构造基因构造基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挠支配基因阻遏蛋白阻挠支配基因构造基因不表达构造基因不表达诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻挠支配基因的作用到阻挠支配基因的作用,构造基因可以表达构造基因可以表达酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟支

18、配基因结合阻遏蛋白不能跟支配基因结合, 构造基因可以表达构造基因可以表达阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白可以阻挠支配基因白可以阻挠支配基因,构造基因不表达构造基因不表达代谢产物代谢产物调控方式 阻遏蛋白 添加物 与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性不转录，继而不翻译诱导物转录，继而翻译乳糖操纵子酶的阻遏无活性阻遏物不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏支配子模型调控作用对比酶合成的诱导与阻遏支配子模型调控作用对比3.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏n指细胞内同时有两种分解底物碳源或氮指细胞

19、内同时有两种分解底物碳源或氮源存在时，利用快的那种分解底物会阻源存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的景象。遏利用慢的底物的有关酶合成的景象。n分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是经用的甲碳源本身直接作用的结果，而是经过甲碳源或氮源等在其分解过程中所过甲碳源或氮源等在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏景象：分解代谢物阻遏景象： 实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培育基上生实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培育基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才

20、开场长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开场利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的个生长延滞期的“二次生长景象二次生长景象(diauxie或或biphasic growth。02468020406080 细胞 浓 度(OD)时 间(h) 这一景象又称葡萄糖效应，这一景象又称葡萄糖效应，产生的缘由是由于葡萄糖降解产生的缘由是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调理基因的产物是环腺苷酸此调理基因的产物是环腺苷酸受体蛋白受体蛋白CRPCRP, ,亦称降解物亦称降解物基因活化蛋白基因活化蛋白CAPCAP。分解代

21、谢物阻遏分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表达达CAP基因基因构造基因构造基因TCAPOCAP结结合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代谢产物谢产物腺苷酸腺苷酸环化酶环化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP的关系的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白：降解物基因活化蛋白catabolic gene activation protein降低降低cAMP浓度浓度使使CAP呈失活形状呈失活形状三、提高酶产量的战略三、提高酶产量的战略一菌种选

22、育一劳永逸一菌种选育一劳永逸 1.诱变育种诱变育种 (1) 使诱导型变为组成型使诱导型变为组成型选育组成选育组成型突变株型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株选育营养缺陷型突变株解除反响阻遏解除反响阻遏 选育构造类似物抗性突变株选育构造类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏解除分解代谢物阻遏选育抗分解选育抗分解代谢阻遏突变株代谢阻遏突变株 2. 基因工程育种基因工程育种 二条件控制二条件控制1. 添加诱导物添加诱导物 酶的底物类似物最有效。酶的底物类似物最有效。2. 降低阻遏物浓度降低阻遏物浓度 除去终产物除去终产物产物阻遏产物阻遏 添加阻止产物构成的抑制剂添

23、加阻止产物构成的抑制剂 防止运用葡萄糖防止运用葡萄糖分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 防止培育基过于丰富防止培育基过于丰富 添加一定量的添加一定量的cAMP3.3.添加外表活性剂添加外表活性剂 离子型离子型 对对细胞有毒害作用细胞有毒害作用外表活性剂外表活性剂 TweenTween8080 非离子型非离子型 添加细胞通透性添加细胞通透性 TritonXTritonX1001004. 4. 添加产酶促进剂添加产酶促进剂n 第二节 酶发酵动力学 n一、细胞生长动力学n 在分批培育(batch culture)过程中，细胞生长普通要阅历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期5个阶段。 EDCBAO细

24、 胞浓度 (g/L)培 养 时 间 (h ) 细胞生长曲线 O-A 延迟期 A-B指数生长期 B-C减速期 C-D 静止期 D-E 衰亡期 n 营养物浓度生长限制基质浓度和生长速率之间的动力学关系：Monod模型n:比生长速率1/h specific growth ratenmax：最大比生长速率1/hnS：营养物浓度生长限制基质浓度 克/LnKs：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，或 mol/LSKSXdtdXsm1 二、产酶动力学二、产酶动力学 一一 酶生物合成的方式酶生物合成的方式 根据酶的合成与细胞生长之间根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为的关系，可将酶

25、的生物合成分为3 3种种方式，即：方式，即： 同步合成同步合成型型 生长偶联型生长偶联型 中期合成中期合成型型 部分生长偶联型部分生长偶联型延续合成延续合成型型 非生长偶联型非生长偶联型 滞后合成滞后合成型型1. 1. 生长偶联型又称同步合成型生长偶联型又称同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步。酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反响产物阻遏。代谢物阻遏和反响产物阻遏。 当去除诱导物、细胞进入平衡期后，当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立刻停顿，阐明这类酶所对应酶的合成立刻停顿，阐明这类酶所对应的的mRNAmRNA

26、很不稳定。很不稳定。a 酶细 胞细胞 或酶浓 度时间生长偶联型中的特殊方式生长偶联型中的特殊方式中期合成型中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开酶的合成在细胞生长一段时间后才开场，而在细胞生出息入平衡期以后，酶的场，而在细胞生出息入平衡期以后，酶的合成也随着停顿。合成也随着停顿。特点：酶的合成受产物的反响阻遏或分解特点：酶的合成受产物的反响阻遏或分解代谢物阻遏。代谢物阻遏。 所对应的所对应的mRNAmRNA是不稳定的。是不稳定的。02468100.00.10.20.30.40.5 细 胞浓度 酶 浓度细胞 浓 度 (OD500)酶浓 度(U/mL)时间 (h) 枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线

27、 2.2.部分生长偶联型又称延续合成型部分生长偶联型又称延续合成型 酶的合成在细胞的生长阶段开场，在酶的合成在细胞的生长阶段开场，在细胞生出息入平衡期后，酶还可以延续合细胞生出息入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。成较长一段时间。特点：可受诱导，普通不受分解代谢物和特点：可受诱导，普通不受分解代谢物和产物阻遏。产物阻遏。 所对应的所对应的mRNAmRNA相当稳定。相当稳定。b酶细胞 细胞 或酶浓 度时 间040801200204060 细 胞浓度 酶浓度酶浓度(单位/ml)时 间 (h)0.012.525.037.550.0细 胞浓度(g/L) 黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线黑曲霉聚半乳糖

28、醛酸酶合成曲线3. 3. 非生长偶联型又称滞后合成型非生长偶联型又称滞后合成型 只需当细胞生出息入平衡期以后，酶只需当细胞生出息入平衡期以后，酶才开场所成并大量积累。许多水解酶的生才开场所成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。特点：受分解代谢物的阻遏作用。 所对应的所对应的mRNAmRNA稳定性高。稳定性高。c酶细胞细胞 或酶浓 度时 间02040608001020304050 酶浓 度 细胞 浓 度细胞 浓 度 (g/L)时 间 (h)01020304050酶浓 度 (U) 黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 总结

29、：影响酶生物合成方式的主要要素 高：可在细胞停顿生长后继 1mRNA的稳定性 续合成酶 差：随着细胞停顿生长而终 止酶的合成 2培育基中阻遏物的存在 不受阻遏：随着细胞的生长而开场酶的合成。 受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开场 合成。 酶消费中最理想的合成方式：酶消费中最理想的合成方式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开场生长就有酶的产生，直的明显差别。细胞开场生长就有酶的产生，直至细胞生出息入平衡期后，酶还可以继续生成至细胞生出息入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。一段时间。 对于：对于：同步合成型：提高对应的同步合

30、成型：提高对应的mRNAmRNA的稳定性，如降的稳定性，如降低发酵低发酵 温度温度 。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使遏，使 酶的合成提早开场。酶的合成提早开场。中期合成型：要在提高中期合成型：要在提高mRNAmRNA稳定性以及解除阻稳定性以及解除阻遏两方遏两方 面努力。面努力。( (二二) ) 产酶动力学产酶动力学普通产酶动力学方程可表达为：普通产酶动力学方程可表达为：XdtdE式中式中 X X细胞浓度细胞浓度(g /L)(g /L) 细胞比生长速率细胞比生长速率(h-1)(h-1) 生长偶联的比产酶系数生长偶联的比产酶系数(IU/g)(

31、IU/g) 非生长偶联的比产酶速率非生长偶联的比产酶速率(IU/(g(IU/(g h)h) E E酶浓度酶浓度(IU/L)(IU/L) t t时间时间(h)(h)生长偶联型生长偶联型XdtdE部分生长偶联型部分生长偶联型 XXdtdE非生长偶联型非生长偶联型 XdtdE 第三节第三节 微生物发酵产酶微生物发酵产酶 一、产酶微生物的分别和选育一、产酶微生物的分别和选育 1.1.优良产酶菌种应具备的条件优良产酶菌种应具备的条件 1 1酶产量高酶产量高 2 2易培育生长速率高、营养易培育生长速率高、营养要求低要求低 3 3遗传性能稳定，不易退化遗传性能稳定，不易退化 4 4易分别提纯易分别提纯 5

32、5平安可靠不是致病菌平安可靠不是致病菌2.2.常用的产酶微生物常用的产酶微生物Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus StreptomycesAspergillus nigerAspergillus oryzaeMonascusPenicilliumTrichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida 3. 3. 产酶微生物的分别和挑选产酶微生物的分别和挑选 1)1)样品的采集样品的采集: :从富含该酶作用底

33、物的场所采从富含该酶作用底物的场所采集样品集样品 2)2)富集培育富集培育: : 投其所好，取其所抗投其所好，取其所抗 3)3)分别获得微生物的纯培育分别获得微生物的纯培育pure culturepure culture。 4)4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。初筛：选出产酶菌种，以多为主。 5)5)复筛：选出产酶程度相对较高的菌株，以质复筛：选出产酶程度相对较高的菌株，以质为主。为主。 -淀粉酶的挑选蛋白酶产生菌的获得方法蛋白酶产生菌的获得方法运用含酪蛋白的培育基运用含酪蛋白的培育基4.4.产酶微生物优良菌种的选育产酶微生物优良菌种的选育 诱变育种诱变育种 原生质体交融育种原生质体交融育种

34、基因工程育种基因工程育种 二二. .微生物发酵产酶方法微生物发酵产酶方法 1.1.固体培育固体培育: :特别适宜于霉菌培育特别适宜于霉菌培育 2.2.液体培育液体培育: :目前酶发酵消费的主要目前酶发酵消费的主要方式方式 3.3.固定化细胞固定化细胞 : :需求特殊的固定化细需求特殊的固定化细胞反响器胞反响器 三三. .微生物酶的类型微生物酶的类型 1.1.胞外酶：大多是水解酶如淀粉酶、胞外酶：大多是水解酶如淀粉酶、蛋白酶、蛋白酶、 纤维素酶、果胶酶，是微纤维素酶、果胶酶，是微生物为了利用环境中的大分子而释放到生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也细胞外的，即使胞

35、外浓度很高，胞内也能维持较低程度，遭到的调理控制少。能维持较低程度，遭到的调理控制少。 2.2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发胞内酶：指合成后仍留在细胞内发扬作用的酶，酶活性和浓度遭到中间产扬作用的酶，酶活性和浓度遭到中间产物和终产物的调控。物和终产物的调控。试管菌种培养茄瓶菌种培养摇瓶菌种培养孢子（菌体）悬液制备种子罐菌种培养发酵罐发酵发酵液预处理酶的分离纯化精制酶发酵消费的普通工艺流程酶发酵消费的普通工艺流程 第四节第四节 动、植物细胞培育产酶动、植物细胞培育产酶 与微生物细胞相比，动物细与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培

36、育工艺。性，需采用各自不同的培育工艺。 动物细胞方式图植物细胞构造 植物、动物、微生物细胞的特性比较植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类细胞种类植物细胞植物细胞微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞细胞大小细胞大小/um20030011010100倍增时间倍增时间/h120.3-615营养要求营养要求简单简单简单简单复杂复杂光照要求光照要求大多数要求大多数要求不要求不要求不要求不要求对剪切力对剪切力敏感敏感大多数不敏感大多数不敏感非常敏感非常敏感主要产物主要产物色素、药物、色素、药物、香精、酶等香精、酶等醇、有机酸、氨醇、有机酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫苗、激

37、素、疫苗、激素、单克隆抗体、单克隆抗体、酶等酶等三者之间的差别主要有：三者之间的差别主要有：植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞。微生物细胞。动物细胞、植物细胞的消费周期比微生动物细胞、植物细胞的消费周期比微生物长。物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。单。植物细胞的生长以及次级代谢物的消费植物细胞的生长以及次级代谢物的消费要求一定的光照。要求一定的光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不一样。物各不一样。一、植物细胞培育产酶一、植物细胞培育产酶

38、 1.1.植物细胞培育的特点植物细胞培育的特点 2.2.培育基特点培育基特点 运用最广的是运用最广的是MSMS培育基和培育基和LSLS培育基培育基 MSMS培育基是培育基是19621962年由年由MurashingeMurashinge和和SkoogSkoog为烟草细胞培育而设计的培育基。为烟草细胞培育而设计的培育基。LSLS培育基是在其根底上演化而来的。培育基是在其根底上演化而来的。3.3.培育方法：培育方法：悬浮细胞培育悬浮细胞培育细胞株的建立；外植体与愈伤组织细胞株的建立；外植体与愈伤组织扩展培育；扩展培育；大罐培育；大罐培育；外植体：外植体： 从植株取出，经过预处置后，用于植从植株取出

39、，经过预处置后，用于植物组织培育的植物组织包括根、茎、叶、物组织培育的植物组织包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等的片段或小块。芽、花、果实、种子等的片段或小块。愈伤组织：愈伤组织： 将上述外植体植入诱导培育基中，于将上述外植体植入诱导培育基中，于2525左右培育一段时间，从外植体的切口左右培育一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。部位长出小细胞团。水稻的外植体幼水稻的外植体幼胚和愈伤组织胚和愈伤组织外植体外植体愈伤组织愈伤组织4. 4. 培育条件的影响与控制培育条件的影响与控制1 1温度温度2 2pHpH3 3通气与搅拌通气与搅拌4 4光照的控制光照的控制5 5前体的添加饲喂前体的添加饲

40、喂6 6诱导子诱导子elicitorselicitors的运用的运用5.5.植物细胞培育产酶实例植物细胞培育产酶实例 以大蒜细胞培育消费超氧化物歧以大蒜细胞培育消费超氧化物歧化酶化酶SODSOD为例为例(1)(1)大蒜愈伤组织的诱导大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、丰满、无病虫害的大选取结实、丰满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%70%乙醇消乙醇消毒毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升汞消毒升汞消毒10min10min，然，然后无菌水漂洗后无菌水漂洗3 3次。次。 在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成0.5cm30.5cm3的小的小块，植入含有块，植入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 1.2mg/L 6-BA 6-BA 的半固体的半固体MSMS培育基中，在培育基中，在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下培育光照条件下培育18d18d，诱导得到愈伤组织，每