拟南芥干旱胁迫的分子和生理分析揭示了植物生长对环境适应的初期反应教学提纲

1、拟南芥干旱胁迫的分 子和生理分析揭示了 植物生长对环境适应 的初期反响精品文档1 .题目：拟南芥干旱胁迫的分子和生理分析揭示了植物生长对环境适应的初期反响2 .背景知识：对由土壤水分亏缺引起的干旱,植物会表现出一系列的抗旱机 制,进一步把这些反抗行为分为干旱逃避和耐干旱两种.干旱逃避是植物整个生长发育过程不与干旱相遇逃避干旱危害,即在干旱 来临前完成生命周期的水平；或植物具有防御干旱的水平,以抵御干旱对植物 的有害影响,使植物在干旱下仍能维持正常的生理状态逆境排外.耐干旱是在植物组织低水势下反抗水分亏缺的水平,植物可以通过代谢反 应阻止、降低或修复由逆境造成的损伤,使其在逆境下仍保持正常的生理

2、活 动.3 .用来检验植物的耐受性和抗性反响的干旱处理方法有很多种：累积干旱pDr即水分被抑制一段时间直到可以观察到萎焉症.这种干旱 处理方法通常用来确定存活率或检测基因表达的变化.然而,累积干旱pDr处理的一个缺点是,由于土壤水分湿度不能控 制,它不能用来比拟不同生长特性下不同基因型的行为功能.为了模拟田间条 件和量化干旱反响,可以利用以下方法：可限制的干旱处理,就是使植物处于土壤水分亏缺的恒定水平,对植物非 致死干旱反响的基因型和生态型进行评估.4 .材料与方法1 .生长条件和干旱处理将拟南芥生态型哥伦比亚种子播于湿润的泥炭团中,分层的在4c放置2天,然后转移至22c 10小时光照100

3、pmole -2i s-1的培养室里.实验的最开始,对做干旱处理的泥炭团在播种之前进行称重以确定泥炭团 里的水分含量.可限制的中等干旱条件mDr是给植物田间持水量的30%,即200%或每克 干土壤含2克水.5.为了做到这点,制作了一个半自动的系统：一个天平连接在计算机上利用软件来操作,软件使输入的重量直接进入 Excel系统,Excel软件运用一 系列的方程计算每个称量的泥炭团中的含水量,最终需水量,所需加水量.每 天都需要对泥炭团进行称量,通过计算补充水分,使其维持在田间蓄水量的30%即mDr水平.本实验分为三组：第一组播种后DAS 25天进行上述处理,第二组播种 30天后处理,第三组播种3

4、5天后处理.同时三组植物分别表现为 ：8片叶子10 片叶子、12片叶子.6. 对累积水分亏缺pDr处理,植物也是在上述培养室中培养,播种后 35天 不给于水分,泥炭团保持枯燥,通过称量泥炭团的重量使其到达所需要的累积 水分亏缺水平pDr.在这项研究中进行两个水平上的测定：萎焉水平和萎焉 前一天萎焉前水平.7. 2.植物生长期生长率的测定收集于网络,如有侵权请联系治理员删除精品文档如上所述,植物在正常生长条件下生长,然后采摘不同时期的植物测其生 物量.第一组播种后25天采摘,第二组播种后30天采摘,第三组播种后35天采 摘.这些日期不像上面所述的干旱处理的时间,而是收获的真正时间.两个不 同发育

5、时期的生长率：播种后25-30天和播种后30-35天,利用公式计算：相对生长率(RGR) =(lnW2-lnW1)/(t2-t1)生长率通过生物量和叶面积来测定.叶面积,通过扫描干旱处理和水分充 足条件下的叶子利用J图像来测定.通过计算相对膨胀率来描述生物量.8. 3.中等干旱条件下的脱落酸和JA突变体在我们的中等干旱条件下可以检测到脱落酸缺乏和 JA突变体的信号.本实验用到的突变体有abil (SALK_076309C),蛋白磷酸化酶,引起对ABA不敏感的显性突变coil (SALK_095916C),对响应茉莉酮酸酯类是必须的jin1 (SALK_061267C),jar1 (CS8072

6、) in Col background,腺甘酸形成酶,abi1 (CS22),aba1 (CS21) in Ler background米黄质环氧化酶,玉米黄质到紫黄质的环 氧化,ABA合成的第一步4.气体交换测定在中等干旱条件下对五个时间点进行测定：中等干旱(mDr)处理的-1,0 ,1 ,2,次.气体交换的测定在气体流动率为 150 m mole S, CO2 400祖moieg 为50%.的条件下用LICOR 6400XT和拟南芥扩展室来测定.9. 5.生化分析干旱条件和水分充足条件下植物进行淀粉分析,对植物在以下不同的时间 点采样：干旱处理(DMD)的1 , 0, 1, 2, 3天水分

7、充足的采样时间 点同上.采样在黄昏淀粉积累量到达最高值时进行.采样后将其保存在-8 0C.将每个样本在液氮中研磨成良好的粉末,称重,然后利用酶染色淀粉试 剂盒对每个样本进行定量分析.脱落酸的量化即在以下不同的时间点采样：中等干旱处理的第0, 1 , 2大.脯氨酸在中等干旱条件下第3,4天取样,用上述方法进行量化.10. 6.基因表达模式分析7 .拟南芥后基因芯片一基因探针图谱分析8 .启动子分析9 .基因功能富集分析10利用qRT-PCR进行基因表达分析11 .植物对适度干旱(mDr)的时间性反响收集于网络,如有侵权请联系治理员删除精品文档为了研究拟南芥对可限制的土壤水分亏缺性干旱反响,在不同

8、的植物发育 时期测定适度干旱mDr效果见图1 o根据限制植物水分的生长时期不同分为三类：播种后 25天、播种后30天、 播种后35天.这些生长时期相当于在拟南芥的6-叶期、8-叶期、10-叶期停止给 植物浇水.3012口“¥零 of in Ur-PW:Pre-will Ing- W：WiltingSsiiinplcsff»r常注戋gMchHn百.and RM Aaolys.cs12 .图2显示了适度干旱mDr处理和水分充足条件相比,最高的生物相 对减少率是在播种后30天进行干旱处理白植物,播种后25天进行干旱处理的也 很明显,播种后35天进行干旱处理对干旱的反响最不敏感图

9、2A.拟南芥生态型哥伦比亚植物的生长速率由两个发育时期决定的：播种后出干物质积累和叶片扩张明显减慢,生长明显受阻AStiagc I Stuge 2I !.cat'Areai25-30K和播种后30-35大.植物的生长速率生物量和叶面积在第一发育阶 段即播种后25-3队比第二发育阶段播种后30-35天高些.图2B由图可以看RB:生物量的相对减少率RGR:相对生长率RER:相对膨胀率DAS:播种后的天数13.收集于网络,如有侵权请联系治理员删除精品文档LRWC叶片相对含水量SWC 土壤含水量DMD mDr的处理时间 WW 充足水分条件DRT 干旱条件在每个时间点测定植物样本和土壤中的相对含

10、水量图 2c和D.14 .叶子的相对含水量LRWC的测量值显示植物在mDr处理前1天开始 感知干旱图2C.在mDr的第0天mDr的开始叶子的相对含水量LRWC减少,一直持 续到适度干旱处理后1天图2c和D.然而,在适度干旱处理后第2天叶子相 对含水量LRWC开始增加到水分充足条件的正常水平图 2C , 土壤含水 量从mDr处理后第1天开始直到mDr处理的最后一直保持恒定不变图2D.15 .激素途径突变体的干旱反响在mDr条件下,敲除ABA信号传送和生物合成反响的基因的突变体在两组 拟南芥中被测定.在可限制的适度干旱mDr条件下和水分充足的条件下相比,生长的减 少量测定的生物量为不同的基因型和野

11、生型相比拟提供了一个参数,区分 出了对干旱敏感/有抗性的变异的基因型.生物量的相对低减率RB = Bww BDRT /Bww Bww是充足水 分条件下生物量；BDRT是中等干旱条件下生物量.6din5n5 .1 I0E- £RB生物量的相对减少率WW 充足水分条件DRT 干旱处理条 件WT 野生型ABA信号发送突变体abil和生物合成突变体abaD和各自的野生型 相比对干旱胁迫更敏感图3A.B.17.收集于网络,如有侵权请联系治理员删除精品文档WT coil jirtl jar ICfllN-OJ茉莉酸反响突变体coil和jinl在mDr处理的第10天显示了显著的干旱抗性 图3c和D

12、.其它茉莉酸反响突变体jarl显示了干旱反响表现型但和野生型 没有显著的差异.这种茉莉酸突变体的反响和coil和jinl相比更加缓和,可能是由于jarl的等位基因并没有完全敲除而是一种氨基酸置换的突变体.18 .对mD反响的气体交换参数的改变25 iiii1<)123OIV1OPn：光合作用gs：气孔导度Ci:内部CO2浓度WW：充足水分条件19 . 在mDr处理后第1天气孔电导率下降至水分充足条件下的59% 图4A.在mDr处理前1天和处理的当天气孔电导率降低将近 50% 图4A,并 且会继续下降直到mDr处理后第2天,大约降低水分充足条件下的40%.在mDr 处理后第3天气孔电导率会

13、增加到水分充足水平.内部 CO2浓度也表现出同样的趋势图4A然而光合作用表现了不同的趋势,mDr处理后第1天没有下降,第2天和水分充足条件的相比下降了 10% 图4A.20 .在mDr处理后第1和第2天瞬时水分利用率WUEi比水分充足条件下高图4B,在mDr处理后第1和第2天高于4 n mol mmol1而水分充足条件下瞬间水分利用率大约为 2 n mol mmo11,在-1,0,3瞬间水分利用率和水分充足条件下相同.图 4B收集于网络,如有侵权请联系治理员删除精品文档DM 1,WUEi:瞬时水分利用效率 WW:充足水分条件DRT:干旱处理条件DMD:中 度干旱处理时间21 .植物对土壤水分亏

14、缺的转录应答反响的描述为了了解干旱胁迫下基因表达的整体效应,以 mDr第1天和第10天和累积 干旱条件下的小叶片为材料进行了微序列基因芯片分析.不同的表达分析 显示了在对mDr反响的早期mDr处理后第1天很多基因2039t都受到了 显著地扰乱.然而,在中等干旱胁迫持续了一段时期后第10天明显较少的基因 728个表现出一些反响.通过这些反响相比照,对累积干旱 pDr即萎焉 的反响中基因表达受到了严重的而影响：7648种差异性表达DE基因-大约占基因组的30%-全都是的压力反响基因和程序.22 .首先在基因水平进行这三种反响mDr处理后第1天,第10天,pDr的比 较图5 . mDr和pDr处理有

15、178个共同的差异性表达基因91个上调,87个下调而mDr处理中有1083个特异的基因545个上调,538个下调rr(*uhited regulatedmDr D10mDr D10(312)mofif piresanit in the draught-rnguIatod genes23.在mDr处理后第1天和pDr处理中的上调基因是主要的水分缺失反响基因(q-值1E-15),对 ABA 刺激(q1E-12.6),渗透压(q1E-8.1),严寒(q1E-4.1)和氧化q1E-2.5的压力反响的重叠基因.这些基因中其中几个表达动力学已通过 qRT-PCR技术被证实.在mDr处理后第1天和pDr的材

16、料中我们的被干旱影 响的细胞的根本过程包括DNA包装q1E2.6,核糖体的生源q1E-2.9和蛋白质折叠q1E-3.2都被下调.因此,植物具有对 mDr的早期反响和对累 积水分亏缺的经典反响是相似的.但是,严重的影响包括光合作用基因q1E-20.7下调及相关过程仅限于pDr.24.大局部典型的水分亏缺反响的基因表达在 mDr处理后第1天和pDr条件下是 上调的,在相似的限制条件下,随着植物生长到持续mDr的第10天其中一些基因甚至被下调q1E-2.8.这些急剧变化的反响很可能是由于植物对持续压 力的适应.在这个阶段中,这些上调的基因中有几个激素 ABA介导的信号 发送基因q1E-2.1,这些基

17、因可能介导了对环境的适应.硫配糖体q1E-收集于网络,如有侵权请联系治理员删除精品文档4) ,IAA-衍生物(q1E-2.9) , JA(q1E-2.8)和特定的长链脂肪酸(q1E-2)的 新陈代谢基因在mDr处理后第10天都是下调基因.细胞壁增厚涉及到的一些基 因(q1E-2.9)和少数调节细月fi生长的基因(q1E-2.8)只有在mDr处理后第10 天和mDr Day10-pDr条件下为下调基因.这些都支持了一般而言持久的水分缺 乏阻碍细胞生长的观点.25 .干旱反响基因的顺式调节为了鉴定顺势调节因子可能介导已鉴定出来的干旱反响基因的转录调节,我们设计了一个转录因子探索传递途径：(CRE-

18、discovery pipeline):利用一个脱-新 基序探索工具FIRE来发现新的因子,并把这些发现的因子和权威数据库的 顺式因子作比照,取出顺式调节因子中有意义的序列.分析mDr处理后1天、10天和pDr基因序列(进一步分为上调和下调)的顺式因 子传递途径,来鉴定几个的和新发现的顺式调节因子(CREs)26 .顺式调节因子突显在 mDr处理后第1天和pDr的上调基因中,这和实验 鉴别的ACGT-包含在ABRE-(ABA响应元件)序列ACGTG(G/T)C中高度相似 (见图5).在pDr-ABRE中位置6(G/T)的简并性恰好保存下来,而在 mDr Day01-ABRE中它是严格的T.有趣

19、的是,mDr Day10的下调基因中发现的一个因子和 ABRE - A(A/C)(A/C)RCGTG 非常相似.27 .在mDr Day01的上调基因和mDr Day10的下调基因中发现另一个支持反 向调节的因子和 DRE/CRT-序列(A/G)CCGAC高度相似.适度干旱处理后第1天(mDr Day01)中的上调基因中鉴别出的 UPRE-类 似因子给予了有力的证实.与此相反,一种 UPRE-类似因子在pDr的下调基因 中被鉴别出来.这里必须指出在mDr Day10和pDr条件下,下调基因中蛋白质折叠非常丰 富,这证实了在这两个处理中蛋白质折叠是受影响的.28 .在mDr Day01上调基因和

20、mDr Day10上调和下调基因中发现了两个富含 AT序列的元件：前者和光反响基因的顺式调节因子相似,后者和拟南芥中限制 生理节奏的夜晚环境基因表达相似.一种新的顺式调节因子(CRE) -(G/T)(A/C)CAGCT(A/C/G)(A/T) < mDr Day10的下调基因中被鉴别出来,它非常丰富但是它的功能我们还不知道.29 .干旱胁迫下细胞的新陈代谢总体的基因表达分析显示了在 pDr-萎焉干旱条件下大量的光合作用基因下调, 而在mDr条件下变化很不明显.在拟南芥中多于 50%的光合作用产物以淀粉的 形式储存.因此,我们检验两种干旱处理中关于淀粉的生物合成和降解基因表收集于网络,如有

21、侵权请联系治理员删除精品文档达的结果.在pDr条件下,淀粉的生物降解中的两种酶即a -淀粉酶、B-淀粉酶,分别以10g21.5、10g23的速率表达.在 mDr条件下只有0-淀粉酶以log20.4 的速率表达.为了证实这些观察结果,在这两种干旱处理中对植物样本进行了量化.在下午的后期采收生长期相同的植物体,即萎焉 1天的植物和mDr处理 后1天的植物.淀粉分析说明在萎焉的植物中没有淀粉积累,而 mDr处理后1 大的植物淀粉累积量和正常植物差不多具体数据未给出 .30 .对mDr处理以时间程序的气体交换测量显示了植物的光合作用速率几乎接 近正常水平图4A.由于拟南芥大于50%的光合作用产物都以淀

22、粉的形式储 存,因此在mDr条件下以时间程序进行的实验中我们需要通过淀粉的量化来确 定气体的交换量.淀粉的浓度在5个时间点来确定：mDr处理的-1,0,1,2,达,这 些时间点的淀粉浓度和水分充足条件下相应时间点的淀粉浓度没有显著地区别数据未给出.为了测定mDr条件下渗透压的适应性,在 mDr的第3天和第4天对脯氨酸的含 量进行了测定.我们发现干旱处理条件下和水分充足条件下相比没有显著地变 化.31 .由于脱落酸ABA是最重要的压力激素,我们也在 mDr条件下以时间程序 进行的实验中对ABA浓度的变化进行了测定.在 mDr处理的当天植物积累了很 高浓度的ABA,浓度继续升高直到mDr处理后1天

23、见图8A,在mDr处理后第 2天ABA浓度开始下降.32 .干旱胁迫下压力信号传送途径基因的表达在pDr萎焉前PPW条件下和mDr条件下相比,ABA生物合成基因NCED3 被多诱导了 4倍见图8B pDr条件下与mDr条件下相比,干旱反响转录因子 DREB2A被诱导至更高的水平.在两种干旱处理中另一个基因RD29B显示了差异性表达,它在pDr条件下被诱导了将近100ts而在mDr处理后第1天它变化了 20倍图8B o测定的其它压力信号传送基因的干旱反响表达水平在两种干旱 处理条件下没有显著的不同图8B.收集于网络,如有侵权请联系治理员删除精品文档33 .压力信号传送途径ABA依赖型和非ABA依

24、赖型中的两种关键基因的 表达水平在mDr处理分析中以时间程序被量化.NCED3是ABA生物合成中的一 种关键酶,它在mDr处理的第0天和第1天与第-1,2,次相比被高度诱导表达图 8C.在mDr处理的当天0day ABF3ABA依赖型途径中的基因的表达量很 高,之后它的表达量降低.在非 ABA依赖型途径中,DREB2A在第0天开始被诱 导表达且持续到处理后第1天,之后它的表达量下降图8D.34. NCED3, ABF3,和DREB2A,的下游有很多反响基因,它们都被认为 是压力标记基因：RD22, RD29A, RD29B, and RAB18.在mDr处理的按时间程 序的实验中,这些标记基因

25、在 mDr处理当天0 Day被诱导表达并且持续到处 理后第1天,之后其表达量降低图8E.35. mDr条件下气孔反响的时间程序分析为了在分子水平了解气孔对mDr处理的反响,在我们mDr微序列数据库中 选择了一系列的气孔相关白基因,来研究它们在 mDr时间进程中的表达动力 学.PLDc 1和GPA1,是气孔中ABA信号传送的两个正调节因子,mDr条件下它 们的表达量从第-1天开始增加到处理后第1天到达最大值,之后开始下降见图 9A.由于在气孔对周围环境的反响中外流的钾离子通道起着很重要的作用, 我们对外流的钾离子通道基因GORK的表达进行了量化,在mDr处理后第1天 GORK的诱导表达量最高,从

26、第2天开始下降图9A.收集于网络,如有侵权请联系治理员删除精品文档36.在气孔反响和ABA信号传送途径中另一组起主要作用的基因属于 属于蛋白质磷酸酶家族C型PP2c§ .因此我们检测了三种主要的PP2c源因 ABI1, ABI2, and HAB1.的表达图谱.在mDr处理的-1天ABI1, ABI2的表达开始上升,一直持续到处理后第 1天, 然后降低图9B . HAB1.在mDr处理的-1天表达降低,在mDr处理后第1天诱 导表达,之后下降图9B.I37 .在气孔中,ABA信号传送的早期反响中,一个类似受体的激酶 1RPK1活性很高,它在mDr的微序列中被诱导表达.在mDr条件下,

27、对RPK1 进行的时间程序分析显示,在 mDr处理的-1天被诱导表达,它持续到处理后第1 天,之后开始下降图9C.0.2538 .在我们的干旱微序列中我们发现 MY60在mDr处理后第1天和pDr条件下被 抑制.已经发现这个基因在保卫细胞中特异性表达,它的无效突变体抑制气孔 翻开.因此我们检测了 mDr条件下按时间程序的反响,在五个时间点对 MY60的 表达进行了量化.MY60在mDr处理的-1天和0天被诱导表达图9D,在处理 后第1天被抑制,从处理后第2天开始稳定直到水分充足图9D.收集于网络,如有侵权请联系治理员删除精品文档39 .干旱胁迫条件下的光合作用和抗氧化基因的表达mDr和pDr微

28、序列比拟显示：很多光合作用基因在萎焉条件下受到显著地 抑制,相反mDr处理条件下其基因表达所受影响不明显见附表 S1.我们选 择了几个光合作用基因,在mDr时间程序实验中它们的表达图谱是光系统1 PSI PQL2, PSAH2和光系统 II PSII PSBW, PSBQA的蛋白质图 10A. PSBW的表达从mDr处理后第1天开始显著降低,到mDr处理后第2天到达最低水 平.然而PSBQA的表达在mDr处理的-1、0、1天都是正常的,从处理后第2天开 始下降.光系统1亚组基因PQL2在mDr处理中的-1、0、1、2天其表到达处于正 常水平,从处理后第3天开始下降.PSAH2在-1天被诱导表达

29、,第0天降低至正 常水平,在处理后第1天和第2天又被诱导表达,在第3受到抑制见图10A.ArsnwPhliQ X 、rsAin t40 .为了测定氧化压力相关的对mDr反响的分子活动,选择了具有抗氧化活性 的6种酶：抗坏血酸盐过氧化物酶1 APX1 ,硫氧化复原蛋白过氧化物酶1TPX1,谷胱甘肽过氧化物酶6 GPX6,胞质Cu/Zn岐化酶CSD1,叶 绿体Cu/Zn岐化酶CSD2和FeM化酶FSD1.APX1和TPX1的表达在时间进程中发生微小的变化图 10B . GPX6在 mDr处理后第1天急剧下降.CSD1和CSD2在mDr处理后第1天和第2天受到显著 的抑制,而FSD1在整个时间进程中

30、变化不显著见图10B2r八1APXIII、1 1CSI>2* =41 .干旱条件下细胞扩张基因的表达收集于网络,如有侵权请联系治理员删除精品文档mDr条件下细胞扩张基因的诱导表达是特异的,同样的基因在pDr条件下被下调或没有差异性表达.通过 mDr和pDr条件下ABA反响基因微序列数据库的比 较,显示了在mDr条件下比pDr萎焉和ABA处理条件下的细胞扩张基因表达开 高.因此,我们对pDr萎焉前PPW和mDrMD处理对细胞扩张基因表达水 平的影响进行了量化,这些基由于：EXPA3, EXPA4, EXPA8, EXPA10,和EXBL1 图 11A.mDr处理后1天大局部扩张基因被诱导表

31、达,而在 pDr条件下EXPA3和 EXPA8被抑制,EXPA4保持不变图11A.人42 .在mDr处理的时间进程分析中EXPA3, EXPA4, EXPA8, EXPA10基因在第0 天被M制,在处理后第1天被诱导表达,随后处理后第2天和第3天表达下降见图11B . EXBL1基因的表达稳定增加直到mDr处理后第1天,然后逐渐下降, 直到处理后第3天到达水分充足条件下的正常表达水平.43 .讨论干旱条件下生长受阻我们的兴趣在于找到干旱条件下植物生长受阻的原因,产生反响的时间,以及 在生理、生化、分子水平上导致生长受阻的原因.干旱转录基因组分析对累计水分亏缺-萎焉pDr-wilting 和中等

32、干旱条件下mDr 1和10天 进行了转录基因组分析比拟,显示了共同的干旱反响过程.此外,qRT-PCR分析显示：在累计水分亏缺-萎焉pDr-wilting和中等干 旱处理的第一大mDr Day01所引起的大局部特征压力信号和压力标记基因 都是相似的.拟南芥植株对中等干旱条件的感受力和对干旱压力的反响与对更剧烈的环 境,萎焉或更干旱处理等致命性条件下都是以同一种方式进行的.收集于网络,如有侵权请联系治理员删除精品文档压力的感受和信号的发出时短暂的,它发生在干旱的早期在干旱压力的初期通过气孔的关闭免除干旱中等干旱条件mDr下光合作用正常也没有氧化压力光合作用速率是通过瞬间气体交换的测量值来决定的,它不受mDr压力处理的影