免疫细胞化学

1、(一) 免疫荧光法 【原理】 ¨ 用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原； ¨ 荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪； ¨ 借助于荧光显微镜进行观察。 1、常用的荧光素 ¨ (1) 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC) ¨ (2) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC) ¨ (3) 四乙基罗丹明 (RB200) ¨ (

2、4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI) (1) 异硫氰酸荧光素(FITC) ¨ 易溶于水和乙醇。 ¨ 最大吸收光谱为490495nm，最大发射光谱为 520530nm呈翠绿色荧光，分子量 389.4。 ¨ 在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记1520个FITC分子。 (2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC) ¨ 最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。 ¨ 与蛋白质结合的方式同FITC。 (3) 四乙基罗

3、丹明(RB200) ¨ 不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。 ¨ 最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。 ¨ RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)，在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸e-氨基反应而标记在蛋白分子上。 (4) 碘化丙啶(PI) ¨ 是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。 ¨ PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择。 ¨ 最大吸收光谱是493nm，最大发射光谱是630nm，呈红色荧光。 2、荧光抗体的保存

4、 ¨ 一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。 一般认为04°C可保存12年，-20°C可保存34年。 要小量分装，防止反复冻融。 保存前需加防腐剂 (浓度为1:500010000的硫柳汞或1:10005000叠氮化钠) 。 3、免疫荧光的染色方法 ¨ 免疫荧光染色法常用的有 直接法 间接法 j原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应 (用来检测未知抗原)。 k直接免疫荧光法的操作步骤 ¨ 标本的处理： 细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然后用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-

5、100 pH 7.4) 漂洗5min × 3/次； 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次； ¨ 2%BSA或10%BSA37湿盒内封闭30min ¨ 抗体染色： 在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37孵育30min； k直接免疫荧光法的操作步骤(续) ¨ 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 ¨ 缓冲甘油封片 分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，

6、0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 ¨ 镜检：在荧光显微镜下观察。 ¨ 优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 ¨ 缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 m直接免疫荧光法的注意事项 ¨ 对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度； ¨ 一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 m直接免疫荧光法的注意事项 (续) ¨ 染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； 染色时间：从10 min到数小时，一般30 mi

7、n； 染色温度：多采用室温(25)，高于37可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2的低温，延长染色时间。 低温染色过夜较37 30 min效果好的多。 m直接免疫荧光法的注意事项 (续) ¨ 试验时需设置下列对照： 自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 ¨ 若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 m直接免疫荧光法的注

8、意事项 (续) ¨ 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； ¨ 经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 (2) 间接法又称为荧光抗-抗体法 j 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。 可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 k间接免疫荧光法操作步骤 ¨ 标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； ¨ 一抗染色： 加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37作用30min或4过夜。

9、 ¨ 0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； k间接免疫荧光法操作步骤(续) ¨ 加荧光标记的二抗抗体，37湿盒避光作用30min。 ¨ 0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)； ¨ 甘油缓冲液封片 ¨ 镜检 ¨ 优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗； ¨ 缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。 m间接免疫荧光法的注意事项 ¨ 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4保存4h，时间过长 ，会

10、使荧光减弱。 ¨ 每次试验时 ，需设置以下三种对照： 阳性对照：阳性血清+荧光标记物 阴性对照：阴性血清+荧光标记物 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 m间接免疫荧光法的注意事项(续) ¨ 标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。 ¨ 一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。 (二) 免疫酶酶标法 【原理】 ¨ 以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位； ¨ 酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。 1、常用的标记酶及其显色底物 &#

11、168; 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物 ¨ 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物 (1) 辣根过氧化物酶(HRP)及底物 ¨ HRP是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成，分子量约40kDa，稳定性好； ¨ 底物为过氧化物和供氢体(DH2) 过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。 供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化 型染料，最常用的供氢体是DAB。 DAB (二氨基联苯胺) ¨ DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不

12、易褪色，电子密度高，最为常用。 ¨ 目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。 (2) 碱性磷酸酶(AP)及底物 ¨ AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色： 偶氮偶联反应，底物为a-萘酚磷酸盐，经水解后得a-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fast blue)或坚牢红(fast red)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。 靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。 2、常用的免疫酶染色方法 ¨ 又

13、分为以下两种方法： 酶标抗体法 直接法 间接法 非标记抗体酶法 酶桥法 PAP法 (1) 酶标抗体法 ¨ 通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。 优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。 缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。 (1) 酶标抗体法直接法 ¨ 将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。 (1) 酶标抗体法间接法 ¨ 将酶标记在二抗上，先将一

14、抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。 酶标抗体间接法的操作步骤 ¨ 标本准备： 石蜡脱蜡至水； 冰冻切片浸入4°C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min×3； 细胞爬片先用PBS洗，然后4°C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min×3； ¨ 石蜡切片需要进行抗原修复，其它标本则不用； (2) 酶标抗体间接法的操作步骤(续) ¨ 封闭内源性过氧化物酶：3H2O2-甲醇溶液室温孵育510min

15、 (湿盒内) ； ¨ 0.01M PBST漂洗，5min×3； ¨ 510%正常山羊血清(0.01M PBS稀释)封闭，室温孵育30min (湿盒内) ； ¨ 倾去血清勿洗，加1BSA(PBST配制)稀释的一抗， 37°C孵育60min 或4°C过夜(湿盒内)； (2) 酶标抗体间接法的操作步骤(续) ¨ 0.01M PBST漂洗，5min×3； ¨ 加HRP标记的二抗室温孵育lh或3730min ； ¨ 加0.01H2O20.05DAB显色 (显色液应新鲜配置)； ¨ 经PBS漂洗3

16、次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。 (2) 非标记抗体酶法酶桥法 ¨ 首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体； ¨ 以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上； ¨ 再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的分布 优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。 几点说明 ¨ 一抗(假设来自种属A)的稀释度可大些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。 ¨ 二抗桥抗体(抗种属A的IgG抗体)应过量，使其Fab段一

17、个与一抗结合，另一个则游离。 ¨ 因抗酶抗体与一抗均系种属A IgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起桥作用，将其连接在与组织抗原结合的一抗上。 (2) 非标记抗体酶法PAP法 ¨ 与酶桥法相似，不同的是，PAP法将酶桥法的第3、4步并为1步，用PAP复合物代替; ¨ PAP是离体制备的复合物(HRP-抗HRP)。 ¨ 显色与酶桥法相同，PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解，形成不溶性终产物。 PAP法评价 ¨ PAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。 缺点：步骤

18、较多，时间较长，不适用于临床常规检查。 ¨ 由于常做石蜡切片，故可用于回顾性研究。 (三) 亲和组织化学法 ¨ 是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。 ¨ 这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。 生物素抗生物素染色法 【原理】 ¨ 生物素(biotin)又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。 ¨ 抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基

19、都有生物素的结合位点。 ¨ 两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。 该系统一端偶联大分子生物反应体系，另一端连结标记物，后者加入酶的底物，产生颜色反应。 (1)标记抗生物素生物素法(labelled avidin-biotin method, LAB)：分为直接法和间接法。 ¨ 直接法 用生物素标记第一抗体，与抗原结合；酶标记抗生物素，与生物素结合，然后进行酶呈色反应。 ¨ 间接法 用生物素标记二抗，酶标记抗生物素，先用第一抗体与组织抗原结合，再将第二抗体与第一抗体相连结，最后进行呈色反应。 (2)桥抗生

20、物素一生物素法(bridge avidin-biotin method，BRAB) 此法是用生物素分别标记抗体和酶，以抗生物素为桥，把二者连接起来，进行呈色反应。 (3) 抗生物素-生物素-过氧化物酶法 (ABC法) ¨ ABC法是在BRAB和LAB的基础上改良的方法。 ¨ ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将其与过量的抗生物素反应而制备的。 ¨ 分为直接法和间接法。 直接法是生物素标记的一抗与ABC复合物结合； 间接法是生物素标记的二抗与ABC复合物结合。 ABC法的评价 ¨ 敏感性强：ABC法比PAP法敏感性高2040倍。 ¨ 特

21、异性强，背景染色淡：由于敏感性高，一抗和二抗都可被稀释至可能的浓度，减少了非特异染色。 ¨ 方法简便，节约时间。可由PAP法所需的2天缩短至几个小时。 ¨ 由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫。免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。免疫组织化学的方法有多种，其实都大同小异，不同点只是在于显色基团！ SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗23次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗2

22、3次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗23次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。8）滴加抗50l，室温静置1小时或者4过夜或者371小时。9）4过夜后需在37复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加抗4050l，室温静置，或371小时；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗1015分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。SABC法1）脱蜡、水化。2）PBS洗两次各5分钟。3）用

23、蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭510分钟，蒸馏水洗3次。4）抗原修复。5）PBS洗5分钟。6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7）滴加抗，室温1小时或者4过夜或者371小时（4过夜后在37复温45分钟）。8）PBS洗三次每次2分钟。9）滴加生物素化二抗，203720分钟。10）PBC洗3次每次2分钟。11）滴加试剂SABC，203720分钟。12）PBS洗4次每次5分钟。13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。15）脱水、透明、封片、镜检。二者区别：sp法是：一抗生物素化二抗HRP标记的链霉卵白素（HRP标记的亲和素）酶标亲和素-生物素技术（labelled avidin-biotin technique，简称LAB法）