器官移植HLA-IgG抗体测定方法的比较研究

1、    器官移植HLA-IgG抗体测定方法的比较研究        【摘要】目的评价酶联免疫法和细胞毒法在器官移植方面 的应用价值。方法采用酶联免疫法(LATM、LAT、STAT)和细胞毒法( LCT)检测211份血清样本HLA抗体，比较其特异性与敏感性，分析三组肾移植受者的致敏状态 。结果除2份STAT测定无结果外，其他样本均获有效结果。与LATM 比较，LAT特异性97.9%、敏感性100.0%、重复性100.0%、变异系数(CV)=5.2%8.9%；ST AT特异性92

2、.6%、敏感性90.6%、重复性94.0%、CV=7.3%12.6%；LCT特异性88.4%、敏 感性89.6%、重复性90%、CV=8.1%15.4%。移植肾失功者HLA抗体致敏率超过80.0% ，首 次尸肾移植术前致敏率20.0%、术后略有升高(27.0%31.7%)。结论酶联免疫法测定HLA-IgG抗体，特异性与敏感性高、重复性好，适合于国内器官移植临床 应用。推荐采用LATM定性筛选、LAT定量分析。【关键词】移植免疫学抗体 A comparative study of different methods for the detection of a nti-HLA-IgG antib

3、odies in organ transplantationTAN Jianming,TANG Xi aoda,ZHOU Yongchang.(Renal Transplantation Center,Fuzhou General Hospital of PLA, Fuzhou 350025,China)【Abstract】ObjectiveTo evaluate some methods in the d etection of HLA-IgG antibodies in organ transplantation.Methods HLA-IgG antibodies in 211 samp

4、le s of serum were detected by means of ELISA including LATM,LAT and PRA-STAT or b y microlymphocytotoxicity(CDC)with LCT.Specificity and sensitivity of the 4 meth ods were compared.ResultsThe assay has been successful either by ELISA or CDC except in 2 samples by STAT.The specificity and sensitiv i

5、ty of LAT assay as compared with LATM was 97.9%100% and the reproducibility 1 00% with CV=5.2%8.9%.For STAT assay,the specificity was 92.6% and sensitivity 90.6% with a reproducibility of 94.0% and CV=7.3%12.6%.The specificity of LCT assay was 88.4%,the sensitivity 89.6% and the reproducibility 90.0

6、% with CV=8.1% 15.4%.Sensitization was over 80.0% in retransplants with hemodialysis and 20.0 % in patients before transplantation for the first time.Sensitization slightly e levated(27.0%31.7%) in po st-transplants.ConclusionsELISA has been more specifi c and sensitive in detecting IgG anti-HLA ant

7、ibodies with well reproducibility and is recommended for clinical application in organ transplantation.Qualitative screening by LATM and quantitative analysis by LAT were recommended.【Key words】Transplantation immunologyAntibody     近年酶联免疫法(ELISA)测定人类白细胞抗原(HLA)、类IgG抗体(简称HLA-IgG)取

8、得重要进展。为评价在我国器官移植临床实际应用价值，我们对三种ELISA法和补体依赖性细胞毒法(CDC)进行了比较研究。报道如下。 材料与方法一、样本移植肾失功恢复血透者85例份，其中首次移植失功56例、第二次移植失功26例、第三次移植失功2例，恢复血透时间为3个月6年；首次尸肾移植术前和术后1周至1个月血清各63份，共计211份。采集外周血3ml，分离血清，置-80保存至测定。二、测定方法1.美国莱姆德混合抗原板(LATM)和莱姆德抗原板(LAT)检测：依据ELISA原理，采用不同的HLA抗原包被泰萨奇板，通过与样本血清中抗HLA-IgG抗体结合而特异性检测出HLA-IgG1。采用Bio-Te

9、k800NB型酶标仪，波长630nm。2.PRA-STAT检测：将HLA抗原包被到普通96孔酶标板，以特异性检测出HLA-IgG2。采用普通酶标仪，主波长490nm、参考波长630nm。3.补体依赖性细胞毒方法3：采用莱姆德公司细胞板(LCT)，将表达不同的HLA-I类抗原活的淋巴细胞包被Terasaki板并冷冻制成细胞板，根据补体介导的抗原抗体反应原理，染色后在显微镜下观察死亡淋巴细胞的比例以判断抗体水平。三、结果分析1.LATM和LAT检测根据附带计算机软件分析测定结果。2.LCT方法设定阳性值为淋巴细胞死亡数40%(评分4分)。3.PRA-STAT：计算cutoff值(平均阳性值

10、5;0.35)，当值(测定孔-样本空白对照)>cutoff值时为阳性，计算%PRA=阳性孔÷46×100%。4.当PRA值>10%时，分析抗体的特异性。5.以LATM结果比较LAT、PRA-STAT和LCT结果的相符率(特异性和敏感性)。四、统计学处理2检验。结果一、有效测定结果2份PRA-STAT检测因空白对照A值太高无法计算，其他均获有效测定结果。当PRA>80%时，因广泛致敏多数难以分辩出抗体特异性。二、HLA-IgG抗体测定结果211份样本中、类抗体均阳性59份，类抗体阳性36份，类抗体阳性10份，阴性106份。各种方法的测定结果见表1。其中LAT

11、方法可准确分辨出抗体的特异性。如980826号样本，类PRA60.0%、类PRA0%，抗体特异性为：A32，A11，A30；970907样本，类PRA3.5%、类PRA25.0%，抗体特异性为：DR53；990061号样本，类PRA50.0%、类PRA66.7%，抗体特异性为：A68，A1，A33，B42，Cw9，DQ5，DQ2。表1LATM与LAT、STAT、LCT检测HLA抗体结果比较LATM结果例数LAT-类LAT-类PRA-STATLCT<10%<80%80%<10%<80%80%<10%<80%80%无结果*<10%<80%80%类+/

12、类+59122360243513324143124类+/类-36119163420728307236类-/类+1010000641900640类-/类-10610600105109690195110合计21111841521393339103792721126930     *2份样本，PRA-STAT空白血清对照A值超过3.0，无法计算结果 三、方法学比较结果1.LAT与LATM结果比较：类抗体特异性97.9%、敏感性100.0%；类抗体特异性100.0%、敏感性97.9%。2.PRA-STAT与LATM比较：类抗体特异性92.6%、敏感性90.6%。

13、PRA-STAT难以判断类抗体的检测结果。3.LCT与LATM比较：类抗体特异性88.4%、敏感性89.6%。LCT无法检测类抗体。四、三组肾移植受者HLA抗体阳性比较结果见表2表2ELISA与CDC方法检测三组肾移植受者HLA抗体结果比较分组例数LATMLATSTATLCT阳性致敏率(%)阳性致敏率(%)阳性致敏率(%)阳性致敏率(%)移植肾失功组857588.27487.17082.46677.6首次移植术前631320.61422.21727.01320.6移植术后631727.01828.61930.22031.7合计21110510610699   &#

14、160; 五、重复性试验阳性血清和阴性血清各5份，重复5次，LATM重复性100.0%；LAT阳性率重复性100.0%、PRA值变异系数(CV)=5.2%8.9%；STAT阳性率重复性94.0%、CV=7.3%12.6%；LCT阳性率重复性90.0%、CV=8.1%15.4%。讨论根据美国器官分享联合网(UNOS)近期对57303例肾移植的分析，致敏受者(PRA>10%)术后排斥率与移植物功能延迟恢复明显增加，存活率明显低于非致敏者。作为影响移植物存活的主要因素之一，检测HLA抗体已作为实质性器官移植术前的常规措施，越来越受到临床的重视与关注4。目前，PRA检测可分三大类。一类是CDC方

15、法3，国外80年代已广泛应用于临床。国内1991年报道采用随机多次淋巴毒试验筛选致敏受者5，1993年报道采用冷冻淋巴细胞检测群体反应性抗体6，1996年开始引进LCT技术。第二类是采用流式细胞仪技术检测HLA抗体。第三类是ELISA方法，包括PRA-STAT技术2和LAT与LATM1。该方法可特异性检测与器官移植密切相关的HLA-IgG抗体而不受其他抗体的干扰，可以确定致敏状态和分辩出抗体的特异性。测定方法稳定，结果重复性好，临床应用方便。国内于1998年引进LAT技术，获得较好的结果。我们采用ELISA与CDC方法对汉族人群HLA抗体进行筛选比较，提出适合我国器官移植的PRA检测方法。21

16、1份样本测定结果显示：ELISA和CDC方法均有较好的相符率和重复性，尤以LATM和LAT结果最好，STAT次之。其中LATM作为筛选大样本受者，快速、简捷，价格低廉，可同时检出类和类抗体，但不能确定抗体水平和分辨特异性。LAT快速、准确，既可确定抗体水平又可准确分辨其特异性，但价格较昂贵。PRA-STAT类似于LAT，但对类抗体的分辨和确定存在一定的困难，个别情况下，空白对照太高导致检测失败。LCT只能检测出类抗体且存在一定的假阴性和假阳性，尤其是所需要的活淋巴细胞运输与保存不便。因此，从我国器官移植实际情况出发，检测HLA-IgG抗体建议先采用LATM作为筛选性试验，对于抗体阳性的受者，再

17、用LAT或PRA-STAT确定抗体水平和分辨抗体的特异性。本课题受国家卫生部科研基金(962289)和中国博士后科学基金资助作者单位：谭建明（350025南京军区福州总医院肾移植中心）唐孝达（上海市第一人民医院）周永昌（美国加州大学组织配型中心）参考文献1，Wang G,Tarsitani C,Denham S,et al.A new micro-Elisa for anti-clas s and class antibody detection.Human Immunol，1998,59133-135.2，Buelow R,Mercier I,Glanville L,et al.Detect

18、ion of panel reactive anti-HLA class antibodies by ELISA assay or lymphocytotoxicity:results of a blinded,con trolled multicenter study.Human Immunol,1995,441-11.3，Hopkins KA.The basic microlymphocytotoxicity assay.In:Zachary AA,Teresi GA. eds.The ASHI laboratory manual.2nd edition.Lenexa.ASHI.1990,195.4，Terasaki PI,Cho Y,Takemoto S,et al.Twenty-year follow