溶血磷脂酸对嗅鞘细胞形态增殖及表达脑源性神经营养因子的影响

1、溶血磷脂酸对嗅鞘细胞形态增殖及表达脑源性神经营养因子的影响         10-05-06 10:18:00     作者：朱仲庚    编辑：studa20【摘要】  观察溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)对体外培养的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)形态、增殖和表达脑源性神经营养因子(brainderived neurotropic factor，B

2、DNF)的影响。方法取成年大鼠原代OECs经纯化后培养，分别用1、5、10、20、50 mL的LPA干预一定时间后，用免疫荧光染色法、MTT、Western Blot技术分别观察OECs形态变化、增殖和表达BDNF的情况。 结果LPA使OECs形态由突起形向扁平形转变，去除LPA可逆转这种转变；150 mL的LPA均能促进其增殖，干预后60 h达到增殖高峰，浓度为10 mL时促增殖作用最显著;150 mL的LPA均可上调其表达BDNF。结论LPA能使OECs形态由突起形向扁平形发生可逆性变化；能促进OECs增殖并具有时间和浓度依赖性；能上调OECs表达BDNF。 【关键词】  溶血磷

3、脂酸 嗅鞘细胞    Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of lysophosphatidic acid (LPA) on the morphology, proliferation and brainderived neurotropic factor (BDNF) expression of olfactory ensheathing cells (OECs) in vitro.MethodPrimary cultures of OECs separated from adult rat olfactor

4、y bulbs were purified and cultured. Five experimental cultures were grown for a period of time in media with LPA at different concentrations, namely 1, 5, 10, 20 and 50 mol/L, and the control culture was grown in the medium without LPA. Immunofluorescent staining was used to identify OECs and to

5、0; observe their morphological changes. The proliferation of OECs was measured by MTT assay. Western blotting was used to detect the protein expression of BDNF.ResultExposure to LPA in medium induced the switch in the dominant morphology of OECs from processbearing to flat morphology. This shift in

6、morphology was reversed when LPA was  removed from media. LPA at concentrations from 1 mol/L to 50 mol/L enhanced OECs proliferation,  especially at the concentration of 10 m/L. Proliferation of OECs in all experimental cultures reached their respective significant peaks after 60 h of LPA

7、treatment. There were significant upregulations in BDNF expression of OECs treated with LPA (150 m/L) compared with those in the control culture.ConclusionA reversible change from process-bearing to flat in morphology of OECs can be induced by LPA. LPA stimulates OECs proliferation in a time and con

8、centrationdependent manner. LPA upregulates BDNF expression of OECs.    Key words：lysophosphatidic acid;  olfactory ensheathing cells;  morphology;  proliferation;  brain-derived neurotropic factor    尽管OECs用于中枢神经损伤修复研究己近20年，并被普遍认为是最有应用前景的候选细胞1，然而对其某

9、些基本的生物学特性如免疫学与形态学关系的认识仍然存在分歧2，3。此外，OECs神经修复作用受到其表达特性的影响，特别是某些神经营养因子如脑源性神经营养因子(brainderived neurotropic factor，BDNF)的表达4；OECs在体外增殖速度很慢，须用增殖剂扩增以后才能满足研究需要。如何促进其增殖又能维持其良好的神经再生特性仍是研究热点。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是磷脂中最简单、最小的分子，通过结合细胞表面G蛋白偶联受体，随后激活G蛋白异源三聚体链接的下游事件发挥各种效应，具有改变细胞形态、刺激细胞增殖、促进胞内钙动员激活多种信号级联反

10、应等生物学作用5。目前关于LPA对OECs的影响，文献鲜有报道。本实验以LPA为干预因素，利用OECs免疫性标志物p75为纯化手段，观察OECs在细胞形态、增殖及表达BDNF的变化，进一步探讨其生物学特性，并为OECs修复中枢神经损伤的研究提供帮助。    1  材料和方法    1.1  材料    成年雌性SD大鼠(200250 g，东南大学医学院实验动物中心)；DMEMF12培养基、N2培养基(美国GIBCO公司)；溶血磷脂酸、MTT试剂盒(美国SIGMA公司)；兔抗低亲合性神经

11、生长因子受体(p75)抗体、兔抗BDNF、抗actin抗体(美国SANTACRUZ公司)；偶联异硫氰酸荧光素羊抗兔IgG、偶联辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(武汉博士德生物技术公司)。    1.2  方法    1.2.1  OECs的原代培养  取成年SD大鼠嗅球，剪碎、消化后通过65 m的细胞滤器制成单细胞悬液，用DF10 S制成密度为6×105ml的细胞悬液并接种在左旋多聚赖氨酸包被的25 cm2细胞培养瓶中，置于37、体积分数5的CO2的环境中维持培养：培养至第3 d每个培养瓶中加入1 m

12、lDF10 S，2 d后全量换液，再过2 d进行纯化。    1.2.2  OECs的纯化  按文献6的方法进行纯化：用1.25 gL胰蛋白酶和0.2 gLEDTA将上述细胞消化成细胞悬液，800 rmin离心并用DF10 S洗涤。再次离心5 min后，细胞沉淀物用DF10 S重新制成密度为6×105ml的细胞悬液，然后接种到未经任何包被处理的培养瓶中，在37、体积分数5的CO2条件下孵育1 h后，将仍然悬浮的细胞接种到包被p75抗体的培养瓶中继续孵育。孵育45 min后，用DMEMF-12洗涤5遍以清除未贴壁的细胞。贴壁细胞即为纯化

13、的OECs。用吸管小心地吸净培养瓶内的培养液，取出预先放置在培养瓶内的玻片作纯度鉴定，瓶内细胞用刮刀收获并用DF-10S制成细胞悬液备用。    1.2.3  OECs的鉴定  利用OECs的特异性标志物p75作细胞免疫荧光染色进行鉴定。用40 gL的多聚甲醛固定30  min，0.01 molL的PBS冲洗3次，加50 g/L的牛血清白蛋白封闭液封闭60 min后，加入兔抗p75抗体(1200)4孵育过夜，0.01 molL的PBS冲洗3次，加入FITC标记的由羊抗兔IgG(1200)37孵育1 h，0.01 molL的PBS冲洗3

14、次。对照实验将一抗用0.01 molL的PBS代替，其余步骤同上，结果为阴性。对p75呈阳性反应的细胞鉴定为OECs。OECs纯度通过随机选取200倍视野，分别于明场下计数细胞总数及荧光视野下计数阳性细胞数，并计算出二者阳性细胞的平均比例。    1.2.4  LPA的稀释和实验分组  LPA的稀释按照文献7的方法进行。下列操作均按照培养液中LPA的浓度的不同分为5个实验组：1 mL、5 mL、10 mL、20 mL、50 mL组。对照组培养液中加入含10 g/L无脂肪酸牛血清白蛋白的PBS。    1.2.5&#

15、160; 细胞免疫荧光染色观察LPA对OECs形态的影响  纯化的OECs以1×104ml的密度接种到左旋多聚赖氨酸包被的内置玻片的6孔培养板中，培养48 h后，弃去培养液，用DMEMF12洗涤3次，更换为N2培养基，培养24 h后再加入各浓度的LPA(对照组仅加入含10 g/L无脂肪酸牛血清白蛋白的PBS)继续培养，24 h后弃去培养液，再次更换为N2培养基继续培养24 h。各组均于每次更换培养条件前及培养结束时随机抽取细胞爬片经细胞免疫荧光染色后观察细胞形态变化，并计算扁平形细胞比例，每组每次均随机选择6个200倍视野进行计数。OECs形态判定标准：OECs形态可分为扁

16、平形和突起形2种，细胞核周围胞浆范围较大且突起少于2个或突起长度小于胞体宽度的为扁平形细胞，胞浆很少，有2个或2个以上突起且突起长度大于胞体宽度的为突起形细胞。    1.2.6  MTT检测LPA干预后OECs的增殖活力  纯化的OECs以1×104ml的密度接种到左旋多聚赖氨酸包被的96孔培养板中，每孔100 l，培养48 h后，弃去培养液，用DMEMF-12洗涤3次，更换为N2培养基，继续培养 24 h。再用各浓度的LPA干预，每组24孔。分别在LPA干预后12、24、36、48、60、72、84、96 h，每组取3孔各加入10

17、 l的MTT，作用浓度为5gL，继续培养4 h后，弃上清，每孔加入100 l的DMSO，待蓝色结晶溶解后用酶链免疫检测仪测定OD值(检测波长为490 nm)，绘制细胞生长曲线，对照组亦按相同方式处理。    1.2.7  WesternBlot检测LPA干预后OECs表达BNDF的情况   纯化的OECs以1×104ml的密度接种到左旋多聚赖氨酸包被的25 cm2细胞培养瓶中，培养48 h后，弃去培养液，用DMEMF12洗涤3次，更换为N2培养基，继续培养24 h。再用各浓度的LPA干预60 h后，吸去上清液，冰冷的PBS漂洗2次，用100 l改良的RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝比色法进行蛋白定量。蛋白上样量为50 g，进行120 gL十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜转膜，50 gL脱脂奶粉非特异性封闭。