日本沼虾性别差异的分子识别机理及检测方法的研究

1、日本沼虾性别差异的分子识别机理及检测方法的研究可行性报告一、研究意义：日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称：淡水青虾、青虾，隶属甲壳纲，十足目，长臂虾科，是我国传统的淡水水产佳品。近年来，该虾养殖发展迅猛，至2003年，全国养殖面积达200万亩，养殖产量突破20万吨大关，总产值达80亿元，成为我国虾蟹类养殖的支柱产业。但在当前的养殖生产中，成熟个体的小型化，养殖规格偏小严重制约了养殖效益的提高。与其他经济甲壳类一样，性别是日本沼虾的一个重要的生物学性状和经济性状。性别不仅决定日本沼虾的繁殖行为，还对其生长速度、个体大小等方面有很大影响，雌雄之间存在显著差异，雄性个

2、体明显大于雌性个体。另一方面，日本沼虾成熟周期仅3-6个月，由于性成熟后个体的蜕壳生长受抑，导致养殖规格偏小。为此，若能专门选育出全雌或全雄的苗种群体进行单性化养殖，则能显著提高商品虾的养成规格、从而大大地提高其养殖效益。已有的研究结果表明，对高等甲壳动物采用外源性激素注射或投喂方法无法改变其群体的性比1，杨丛海等2用高温处理中国对虾受精卵和胚胎发现对其群体的雌雄性比有影响，雌性个体数量明显高于雄性个体数量。另外也有利用光周期调节3、切除或移植雄性腺或卵巢等手段4、5改变高等甲壳类性别的报道。这些方法都可能在日本沼虾上得以应用。但应用上述方法得到的假雌或假雄个体与正常个体外形上没有任何区别，由

3、于目前无法找到一种有效的检测方法，从而难于用假雌或假雄个体与正常个体交配的方法得到全雄或全雌化苗种。在一些高等甲壳动物中，如绒螯蟹属、长额虾属的一些种类，存在异型性染色体，可以用染色体组型分析来寻找假雌或假雄个体与正常个体的区别，但是，迄今为止，在沼虾属中的罗氏沼虾、日本沼虾未发现有明显的特化的性染色体，寻找雌性蛋白的努力也尚未取得成功，这表明用传统的细胞学、蛋白质检测方法无法有效判别两性的遗传差异。为此，本项目将通过对已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNA的提取，用RAPD、AFLP、Sry基因测序等多个分子生物学检测方法，旨在寻找到日本沼虾性别差异的分子标记，并建立日本沼虾性别差异的分子检测方

4、法，这为建立日本沼虾分子标记连锁图，为今后开展早期幼体雌雄或者性逆转个体基因型鉴定方法的建立提供重要的基础数据和技术，并为最终日本沼虾苗种的单性化以及人工雌核发育等研究奠定基础。二、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系项目主要研究目标：1、找到日本沼虾雌雄个体的分子差异（RAPD差异、AFLP差异、Sry序列差异），获得判别日本沼虾雌雄个体的分子标记。2、通过日本沼虾性别相关基因Sry与其他动物Sry基因的聚类分析，分析日本沼虾在生物系统进化上的位置。3、建立日本沼虾性别差异的分子检测方法。本项目组成员的长期目标是进行日本沼虾性别控制的研究，其中包括单性化苗种培育试验。本项目完成后，如

5、果能够得到雌雄个体的分子标记，则可利用该标记，设计出简便、有效的性别分子检测方法。再通过物理及其它方法改变日本沼虾苗种培育环境，得到部分假雌或假雄个体，待假雌或假雄个体性成熟后，经分子标记检测，再与正常个体交配，就可以得到全雌或全雄的苗种。 因此，本项目是日本沼虾性别控制研究的基础，是达到长期目标的一个必须攻克的课题。三、项目研究内容，研究方案和进度安排主要研究内容：1、已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNA的提取：取日本沼虾雌雄个体的肌肉组织，参考Sambrook的方法，试用几种不同的裂解液，提取已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNA，比较不同方法得到的DNA的质量。2、从分子水平出发，通过RAPD

6、和AFLP等方法分析已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNA间的多态性，筛选与其性别相关的RAPD分子标记和AFLP分子标记。3、对已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNA进行Sry基因扩增、SSCP分析、测序，分析雌、雄个体间的单核苷酸多样性差异，最终找出雌、雄个体间的Sry序列差异。4、建立性别差异的分子检测方法：综合比较RAPD分子标记、AFLP分子标记和Sry基因序列标记，建立性别差异的分子判别方法，并应用这些方法对已知的日本沼虾雌雄个体性别进行回判，在对其进行评估、完善的基础上，建立简便、灵敏度高的性别分子检测方法。研究方案：本项目将从以下几方面来实施： 已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNA的提取

7、：取日本沼虾雌雄个体的肌肉组织，参考Sambrook的方法，试用几种不同的裂解液，提取已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNA。对提取的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测,OD260测定和UVP凝胶成像仪拍照分析,以确保提取的DNA样品的纯度和浓度符合进一步实验的要求。 RAPD：优化日本沼虾RAPD扩增的最佳条件，利用优化条件，以已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNA为模板，扩增出日本沼虾雌雄个体之间的差异条带，筛选与日本沼虾性别相关的RAPD分子标记。 AFLP：利用AFLP技术,应用多个引物组合, 以已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNA为模板，进行AFLP扩增，检测日本沼虾雌雄基因组的多态性,筛选与日

8、本沼虾性别相关的AFLP分子标记。 Sry基因测序： 通过提取已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNA和设计特定引物扩增出日本沼虾Sry基因，SSCP分析，然后测序，比较雌雄个体Sry基因的单核苷酸差异， 并在genebank中与其他物种的Sry序列进行blast比对，作聚类分析。实验手段：本研究将使用已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNA的提取、琼脂糖凝胶电泳、日本沼虾雌雄基因组的RAPD扩增与分析、AFLP分析、Sry的特定引物特定引物设计与PCR扩增、SSCP分析、测序、聚类分析等方法。关键技术：本研究中的关键技术是日本沼虾雌雄基因组的RAPD、AFLP 及Sry基因的引物设计、SSCP分析和测序

9、技术。技术路线：提取已知性别雌雄的日本沼虾基因组DNARAPD引物设计 酶切后，与特定接头相连接 设计特定引物 优化扩增条件 预扩增 PCR扩增RAPD扩增 选择性扩增 SSCP分析和测序多态性比较 多态性比较 核苷酸差异比较找出RAPD 找出AFLP 找出Sry基因序列差异条带 差异条带 差异，进行聚类分析进度安排：本项目计划在2006-2008三年内完成，各年度计划如下：2006年：完成日本沼虾基因组DNA的提取和RAPD研究，找出日本沼虾雌雄个体之间的差异条带，找出与日本沼虾性别相关的RAPD分子标记。2007年：完成日本沼虾雌雄个体的AFLP筛选，找出与日本沼虾性别相关的AFLP分子标

10、记。2008年：完成日本沼虾雌雄个体的Sry基因测序，比较雌雄个体Sry基因的单核苷酸差异，作聚类分析，完成指标，通过验收、鉴定。四、项目创新之处本项目在国内外首次研究日本沼虾性别决定、性别分化的分子机制，并建立简便、灵敏度高的性别分子检测方法。关于日本沼虾的研究资料很多，但关于其性别方面的只有形态学的差异研究6和染色体的研究7，未发现有关于青虾的性别决定机理、性别分化机制的研究，也没有关于分子识别方面的研究。近年来，利用分子标记寻找性别差异片段的成功报道开始增多。在RAPD方面，邱涛等8用RAPD技术来识别中华绒螯蟹的性别差异，结果发现雌雄中华绒螯蟹存在性别特异性分子标记。高连勇等9推侧中国

11、对虾的性别决定为基因决定型，这一发现与Naylor10的报道相似，即在对虾属(Penaeus)个体中存在着性别决定基因。但至今还没有分离到性别决定基因，可能是由于虾蟹类染色体组(基因组)雌雄性别间差异很小，克隆探针较难，难以直接用物理图谱基础上的大片段克隆方法获得。其它分子标记方法如AFLP和微卫星DNA等在虾蟹中的研究亦有报道。王艺磊等11利用AFLP技术来筛选锯缘青蟹性别差异DNA片段，结果共扩增出4312条带, 筛选出候选差异片段748条。Moore等12利用246个多态性的AFLP标记，构建了1个具有44个连锁群的日本对虾AFLP图谱，这是甲壳动物乃至水生无脊椎动物中首次报道的连锁图谱

12、。南美白对虾中也有大量微卫星座位等标记的报道13。应用在高等脊椎动物中性别特异的探针如SRY (sex-determining region of the Y chromosome) , ZFY (sex-determining region of mammalian Y encoding a zinc-finger protein)、Bkm(banded krait minor)、DMY (doublesex/mab-3 domain of chromosome)和DMRTl (DM-related transcription factor)来寻找虾蟹类的同源基因也是一种简捷的手段。贺艳萍等

13、14用特异于人HMG盒(high mobility group box)区域的1对引物，对克氏螯虾( Cambarus clarkii)的基因组DNA进行PCR扩增，并以DIG标记的人的SRY基因为探针，与扩增产物进行Southern杂交，结果表明其雌雄个体中皆存在SRY基因的同源序列，但其杂交过程中显色很慢且显色条带很弱，这可能与它进化地位低有关(同源程度低)。刘艳红等15对锯缘青蟹与Sry相关的Sox基因进行了PCR扩增，得到了一个与人的SOX基因同样大小的216bp的片段，但未进行测序，也未检出雌雄个体的差异。彭巧玲等对罗氏沼虾的Dmrt基因进行序列分析，结果发现3个Dmrt基因，与其他

14、动物相关的Dmrt基因进行聚类分析，显示Dmrt基因在进化系统上高度保守，序列上的相似性可能暗示它们在功能上的相似性。以上综述表明，利用分子识别来判断高等甲壳动物性别差异已在多个种类上获得了成功，这些研究方法也可借助于日本沼虾，但至今未有关于日本沼虾性别差异的分子识别的研究报道。因此本项目是第一次将分子识别用于日本沼虾的性别研究，具有应用创新的特性。 五、工作基础与工作条件本项目组曾在2001年主持省级重点科研项目“日本沼虾种质改良技术研究”的具体实施工作，技术水平国际先进水平，对日本沼虾的的种质遗传背景进行了系统的研究。项目组成员在德国亚琛工业大学生物实验室参与转基因研究，对分子生物学方面有

15、较好的理论基础和熟练的实验操作技能。单位研究开发情况：本单位现有科技人员60人，其中具高级职称的27人，中级职称11人。单位成立以来，共有获奖成果62项，其中，国家级9项、省部级42项。获国家科技进步一等奖1项、国家发明二等奖1项、部科技进步一等奖3项。本单位科研设施齐全，有生物学、生物化学、种质分析、品种繁育、水化学、饲料分析、水域环境监测、鱼类细胞生物学、鱼类免疫学研究等方面的实验室和相应的仪器设备及试验基地为我省公益类研究所，在水产新品种开发、饲料与营养、种质分析、水质测定、养殖技术等方面居国内先进地位。六、预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路本项目完成后，可找到日本沼虾雌

16、雄个体的分子差异，获得判别雌雄个体的分子标记；分子聚类分析得出日本沼虾在生物系统进化上的位置；摸索出日本沼虾性别差异的分子识别方法。 成果提供形式：发表论文4篇。获得判别日本沼虾雌雄个体的分子标记后，设计简便的性别检测方法。下一步将进行日本沼虾单性化苗种培育的试验。具体思路如下：通过物理方法改变日本沼虾苗种培育环境，得到部分假雌或假雄个体。待假雌或假雄个体性成熟后，经分子标记检测，再与正常个体交配，就可以得到全雌或全雄的苗种。日本沼虾单性化苗种培育的研究将通过申请浙江省重点攻关农业项目资助和自筹资金来进行进一步研究。七、参考文献1、Sarojini,S. Comparison of the e

17、ffects of androgenic hormone and testoster-one propionate on the female ocypod crab. J.Curr. Sci. 1963,33(9):411412.2、杨丛海. 高温处理中国对虾受精卵对性比结构的影响。J.海洋科学,1993,4:12.3、Spencer R. Malecha , Patricia A. Nevin ,etc. Sex-ratios and sex-determination in progeny from crosses of surgically sex-reversed freshwate

18、r prawns, Macrobrachium rosenbergii. J. Aquaculture, 105(3):201208.4、Sagi, A. Effect of androgenic gland ablation on morphotypic differentiation and sexual characteristics of male freshwater prawns, Macrobrachium rosenbergii. J. Gen. Comp. Endocrinol. 1990, 77:1522.5、Nagamine, C., W.A. Knight. Induc

19、tion of female breeding characteristics by ovarian tissue implants in androgenic gland ablated male freshwater prawns Macrobrachium rosenbergii(de Man) (Decapoda, Palaemonidae). J. Intern. J. Invert. Reprod. and Develop. 1987, 11:225234.6、倪娟、赵晓勤、陈立侨 日本沼虾4种群形态学差异及判别J. 待发表7、邱高峰、堵南山，赖伟 日本沼虾染色体及其核型的研究J.海洋与湖沼，1994,25(5) :493498.8、邱涛、陆仁后、项超美等 用RAPD技术识别中华绒螯蟹性别差异。 J. 水产学报，1998，22（2）：1751779、高连勇，刘英杰，王玉梅. 对虾遗传育种研究进展J.河北渔业，1992,62(1):810.10、Naylor C. Variation in sex determination in natural population of a shrimp. J. Ecol Biol