WB试验基本步骤

1、精品文档实验基本步骤提取细胞蛋白BCA 定量制备蛋白胶（SDS-PAGE 交）蛋白样品变性电泳转膜封闭一抗TBST 洗涤二抗TBST 洗涤显影结果分析1欢迎下载精品文档试剂配制1.PBS 磷酸盐缓冲溶液 1L磷酸二氢钾0.24g磷酸氢二钠1.44g氯化钠8g氯化钾0.2g加入 500ml 纯水，调 PH=7.2定容至 1L,高压蒸汽灭菌2. PBST（ PBS+0.05%吐温 -20）500mlPBS+0.25ml 吐温-203. 电转液 500mlTris 1.5g甘氨酸 7.2g400ml 水溶解加入 100ml 甲醇，置于 4 C 冰箱预冷4. 电泳液（1X）10 x 稀释，50ml10

2、 x 电泳液+450ml 纯水5. TBS6. TBST （TBS+0.05%吐温-20 ）50mlTBS+450ml 纯水 +0.25ml 吐温-207. 封闭液TBST1X+5 奶粉40ml 封闭液=40mlTBST+2g 奶粉，40 C 预热2欢迎下载精品文档WB 实验、蛋白样品制备准备：一管细胞，PBS（ 4C 预冷），PMSF（ 100mM，移液枪（1000ul , 10ul ）, 1.5mlEP 管 2 个，高速冷冻离心机 4 C 预冷1. 于-20 C 冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液2. 加入 1ml 4 C 预冷的 PBS（ 0.01M pH7.27.3 ）。用移液枪轻轻吹

3、成悬浮液后4 C, 8000r 离心 5mi n,然后弃去上清。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。3. 按 1ml 裂解液加 10 卩 l PMSF（100 mM，摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4. 在样品中加入 300ul 含 PMSF 的裂解液，吹匀，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5. 裂解完后，于 4C 下 12000 rpm 离心 5 min。7.将离心后的上清分装转移倒 0.5 ml 的离心管中放于一 20C 保存。二、蛋白含量的测定（BCA 定量）准备：96 孔板，移液枪（1000ul , 10ul , 20

4、0ul ）, BCA 工作液（A+E） , 50mlEP 管，1xPBS, BSA 标准液1. 将 96 孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用）2. 算好孔数（总的）每孔加 200ulBCA 工作液（A+B） , （A 液：B 液=50:1，一般配多些，如 60 孔，A 液 12000ul ,B 液 240ul ）3. 将样品稀释到一定倍数才能定量，（10 倍，20 倍，30 倍），每孔需要 20ul 样品（2ul 样品+18ulPBS,即稀释 10 倍），做三个重复则需要 60ul，一般配 80ul4. 配蛋白标准样品，将 2mg/ml 的蛋白标准溶液稀释至 0.5m

5、g/ml，若配 200ul 的 0.5mg/ml 蛋白标准溶液则需要 50ul 的 2mg/ml 的蛋白标准溶液和 150ul PBS 溶液5. 将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0, 1,2,4,8,12,16,20加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS 补足到 20ul6. 每孔加 200ul 配好的工作液，平行加，不能上下加，以减少误差7. 将加好的 96 孔板放在 37 C 下孵育 30 分钟8.孵育完后，放在酶标仪轻微震荡 3-10S,中速,吸光值 595nm,进行比色测定，记录标准曲线及样品吸光值数据后，以蛋白含量（ml）为横坐标，吸光值为纵坐

6、标作标准曲线。（R20.98 才有用，酶标仪操作：两个箭头 图标,1 是结果,2 是保存）3欢迎下载精品文档9.计算蛋白含量（注意定量样品已经稀释了10 倍）蛋白质定量标准曲线加样量骨口. 序号12345678标准蛋白量/ul0128121620(0.5mg/ml)4背景液（PBS /ul2019181612840标准液浓度mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5三、SDS- PAGE 电泳1.配胶（12%,可以提前配好）准备：玻璃板，梳子，AP （解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（4 C 冰箱冷藏）（1）玻璃板验漏 5mi n（2 ）按表配置分离胶（3）灌胶，加酒精封压，凝

7、30min （注意不要有气泡）（4）按表配浓缩胶，倒掉酒精，用吸水纸吸去酒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝30mi n（5） 取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中4C 冰箱保存备用2.样品处理准备：PBS 移液枪，1.5mlEP 管（1） 稀释样品：一般每孔上样 5ul，即 1mg/ml 浓度的样品，测完蛋白含量后，将样品用PBS 稀释至 1mg/ml（注意 loadingbuffer的加入也得算入）（2）取出上样样品 15ul 至 1.5 ml 离心管中，加入 6X SDS 上样缓冲液 3ul 至终浓度为 1 xo（上样总体积一般不超过 15 卩 l，加样孔的最大限度可加

8、20 卩 l 样品。）（3）将样品在 100C 煮 5 min 震荡使蛋白完全变性（注意仪器操作）3.电泳准备：电泳液 500ml （现配），蛋白胶，10ul 移液枪（枪头），样品， Marker,冰盒，电泳装置（1 ）将 SDS-PAGE 交放入电泳槽中，加足够的电泳液。（短玻璃板面向内，长玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。）（2）上样。用移液枪贴壁吸取样品， 将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电

9、泳 缓冲液中洗涤3 次，以免交叉污染。）4欢迎下载精品文档（3）先设置 80V,开始电泳，样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120V 电压，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。（此时准备好电转液）四、转膜准备：电转液（现配 4 C 冰箱冷藏），镊子，滤纸，PVDFM（ 0.45um），电转装置，冰盒注意：拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子，因为手上的蛋白会污染膜。1.在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫2. 滤纸浸入电转液中，PVDF 膜在甲醇中润湿成半透明，小心将膜放入4C 电转液中平衡至少 5min。3.将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气

10、泡。（一 手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。4. 先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松 动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影 响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上（做好标记），用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，

11、要不断的擀去 气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开 门以使空气流通。）5.将夹子放入转移槽中（电转移时会产热，浆槽放入冰中），要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的 红面。一般用100mA 转移 90min。6.转完后将膜用 1X 丽春红染液染 5 min （于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜 上的蛋白。将膜晾干备用。（准备封闭液）六、免疫反应准备：封闭液，一抗，二抗，TBST1 .将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。2.TBST 洗 4 次。每次 5 分钟。3. 将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记，加入相对应的一抗，室温孵育2h 或者 4 C 过夜4. 室温下孵育 12 h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min5.同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育12 h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗 4 次，每5欢迎下载次 5 min七、显影准备：样品胶片，移液枪（200ul ），中枪头，吸水纸，显影液（A+B，薄镊子二抗28kd目的蛋白17kd Sep15 1:10001.将 A 和 B 两种试剂在保鲜膜上等体积混合；2.1 min 后，取适量显影液于显影仪台面上，将膜用镊子夹起来正反面充分和显影液接触，注意切角在左上,即正面