丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备朱一凡

1、丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备班级：生药1411姓名：朱一凡 学号：2014044146 指导老师：邓玉营一、简介一、简介聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂又称为共聚体的N, N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE）。与其他凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH和温度变化较稳定。几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一

2、致，则样品分离重复性好。样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。二、电泳基本原理二、电泳基本原理蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋

3、白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。三、实验器材及试剂三、实验器材及试剂1、试剂 分离胶缓冲液（Tris-HCL缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。电泳

4、缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6g, 甘氨酸28.8g, 用无离子水溶解后定容至1L。用时稀释10倍。30AcrBis贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。TEM10%过硫酸铵（新鲜配制）；25%蔗糖溶液；0.05%溴酚蓝溶液；7%冰乙酸溶液。染色液：称取考马斯亮蓝R250 2.5g，冰乙酸92ml，甲醇454ml，加去离子水454 ml使其完全溶解，过滤ED；后置棕色瓶保存。脱色液：取甲醇50ml，冰乙酸75ml，加蒸馏水至1000ml。2、器材：垂直板型电泳槽、天平、直流稳压电源、50或1

5、00l微量注射器、玻璃板、水浴锅、染色槽、烧杯、吸量管、胶头滴管四、实验步骤四、实验步骤1、 安装垂直板电泳槽（1）将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠；（2）用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，玻璃室凹面朝外，插入斜插板；（3）用蒸馏水试验封口处是否漏水。 2、制备凝胶板 （1）分离胶制备： 取Acr-Bis储备液 5.0mL, Tris-HCl缓冲液 PH8.9 2.5mL, 去离子水12.39mL, TEMED 0.02mL置于小烧杯中混匀，再加入10% 0.1mL过硫酸胺，用磁力搅拌器充分混匀2min。混合后的凝胶溶液，用细长头的吸管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度

6、距样品模板梳齿下缘约 1cm。用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水（约34cm），用于隔绝空气，使胶面平整。 分离胶凝固后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。倒掉重蒸水，用滤纸吸去多余的水。（2）浓缩胶制备：取Acr-Bis储备液1.0mL， Tris-HCl 缓冲液（PH6.7）1.25mLTEMED0.01mL, 去离子水7.64mL，10% 过硫酸胺0.1mL，用磁力搅拌器充分混匀。混合均匀后用细长头的吸管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。待浓缩胶凝固后，轻轻取出样品模槽板。用手夹住两块玻璃板，上提斜插板，

7、使其松开，然后取下玻璃胶室去掉密封用胶框，用1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。插入斜插板，将电泳缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，外槽缓冲液加到距平玻璃上沿3mm处。3、加样 （1）各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.51mg/mL，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。 （2）一般加样体积为1015L（即210g蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。 （3）用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。4、电泳 （1）将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离较时，将电流调至203

8、0mA。 （2）当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。5、染色 将凝胶放入考马斯亮蓝R250染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右6、脱色 弃去染色液，将凝胶置于脱色液中，并经常更换脱色液，直至背景蓝色褪去。如用50水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。脱色液经活性炭脱色后，可反复使用。五、注意事项五、注意事项 （1）Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱内进行。 （2）玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。 （3）样品槽模板梳齿应平整光滑。 （4）用琼脂封底及灌凝胶时不能