qPCR试验操作流程49091

1、Q-PCR实验流程一、实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开1520分钟。超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。取EP管/枪头时需用蹑子，不可以用使用过的手 套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。橡胶手套须放入超净台 照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最 大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超 净台前讲话。二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入 1ml Trizol （ Invitro

2、gen）溶液，吹打混匀，并吸至 1.5ml RNase free EP 管中 使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1 ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温 放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200卩氯仿，剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触，室温静置35min:（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好， 与第一步的顺序一致）3）4C下，14,000g离心15min,可见分为三层，RNA在上层水相，移 至另一 个新的RNase free EPW；（用20200ul的枪吸取上清，吸上清 时,枪

3、头应沿 着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA:加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒 68次）（不 应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4C下，14,000g离心10min,收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管 底部 有沉淀，应将EP管放置在80度冰箱过夜，继续在4C下，14,000q离心 10min,收集RNA沉淀），去上清：6）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠 倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不 能过干或过 湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶

4、解沉淀。三、去基因组使用RNase-free的DNase ? （Promega）,按以下体系配置反应液，37°C消化 30min, 65C 灭活 10minoRNA30DNase ?2010 x buffer10H2O(RNase free)39.5RNasi n0.5总体积100然后按以下步骤操作：1）加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min,后14,000rpm, 离心15mi n,取上清。2）加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm,离心15min, 取上清。3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒68次），20C静置15min；4）4C下，

5、14,000g离心15min,收集RNA沉淀，去上清；5）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）,超净台风干；6）加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。四、总RNA纯度和完整性检测1）纯度检测：取1 P I RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值， OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。2）总RNA完整性检测：取RNA样品1门1 %琼脂糖凝胶电泳80VX20min, EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5srRNA,18s rRNA和28srRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。五、逆转

6、录1. mRNA :1）在RNase free的PCR管中配置卜列溶液.Total RNAH2O1.0Pg Pl总体积122）将上述溶液吹打均匀，置85C保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性；3）在该PCR管中加入下列试剂（Promegaoligo (dT)0.5Ran dom primer0.510mMdNTP2.0RNase in hibitor0.5P5 x buffer4.0PM-MLV0.5P总体积8.0P4）将上述20卩反应溶液30C保温10min；5）42T 保温 50min；6）85T 保温 10min；7）-20 C 保存。2.microRNA :使

7、用茎环逆转录法,原理如下图:miRNART prlmarStep 1: SLem-loop RT屮HHcONAStep 2:Rea l-time PCRForward primerReverse primer1）在去RNase的PCR管中配置以下溶液total RNAX个miR逆转录引物H201.00.5*XPgd总体积12.5PJ2）将上述溶液混匀，85C孵育5min,以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以 防止RNA复性再次恢复二级结构；3）在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：10mM dNTP (promega)2.0RNase in hibitor (promega)0.5

8、U6逆转录引物0.5d5x buffer4.0dM-MLV (promega)0.5d总体积7.5d4）将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30C保温10min；5）42C 孵育 50min；6）85E孵育10min灭活逆转录酶。四、定量PCR检测1 引物测试：根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反 应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、 水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好， 则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引

9、物进行正式实验。2 确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。（1） 一个样品的加样尽可能安排在同一行（2）如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板3 正式实验：体系配制：H2O4ulSYBR Green PCR Master Mix10ul （TOYOBO）（使用前需振荡均Zn、上游引物0.5ul(10uM)下游引物0.5ul(10uM)总体积15ul计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配0.5份1份体系。总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。3

10、. cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后，即可加至 刚配好的反应体 系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标 记好的顺序（不可 将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每 孔均盖紧，否则影响重复性或可能岀现熔解曲线峰漂移。）4. 把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。五上机：5.1先开电脑，进入Windows界面。接着打开PCR仪电源开关。5.2打开7500软件，选择“新建”,在“ Template"下拉菜单中选择“ 60”或“65” （普通基因检测为“ 60”，MicroRNA检测为“ 65”）5.3打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位。5.4点击File菜单中Save,输入要保存结果的文件名，命名为日期上机时间客户名字简写，如100830-1008-WL表示8月30日10点08分魏立的实验。5.5点击Start键，开始运行程序ABI