组织工程医疗产品第25部分动物源性生物材料DNA残留量测定法

1、组织工程医疗产品第25局部动物源性生物材料 DNA残留量测定法ICSC中华人民共和国医药行业标准YY/T XXXX.3,20XX组织工程医疗产品 第25局部动物源性生物材料DN岷留量测定法：荧光染色法Quantification of Residues DNA in Biological Materials:Fluorescence Method送审稿20XX-XX-XX 发布 20XX-XX-XX 实施国家食品药品监督治理局 发 布YY/T XXXX.3,20XX目次前言2引言 3 1范围 4 2标准性引用文献4 3术语、定义及缩略词实施标准概要55意义和使用6 6实验方案和技术依据6 7试

2、剂和仪器7 7.1试剂7.2仪器和器材8 试验过程8.1 蛋白酶K消化8.2 DNA 纯化8.3 DNA含量测定荧光染色法9结果计算10结果判定11生物材料残留DNA艮量的讨论参考文献1YY/T XXXX.3,20XX、乙 刖H本标准的编写格式贯彻了 GB/T 1.1-2021?标准化工作导那么 第1局部：标准的 结构和编写?.本标准为原创标准,无同等或类似的国际标准.本标准的某些内容可能涉及专利,本文件的发布机构不承当识别这些专利的责任.YY/T 0606?组织工程医疗产品?系列标准如下：组织工程医疗产品第1局部：通用要求组织工程医疗产品 第2局部：术语第3局部：通用分类 组织工程医疗产品组

3、织工程医疗产品 第4局部：皮肤替代品物的术语和分类第5局部：基质及支架的性能和测试组织工程医疗产品组织工程医疗产品第6局部:？型胶原蛋白组织工程医疗产品第7局部：壳聚糖组织工程医疗产品第8局部：海藻酸钠组织工程医疗产品第9局部：透明质酸钠组织工程医疗产品第10局部：修复或再生关节软骨的植入物的体内评价组织工程医疗产品 第11局部：脱钙骨异位骨诱导性组织学评价指南组织工程医疗产品第12局部：细胞、组织、器官的加工处理指南组织工程医疗产品 第13局部：细胞自动计数法组织工程医疗产品 第14局部：评价基质及支架免疫反响的试验方法-ELISA法组织工程医疗产品 第15局部：评价基质及支架免疫反响的试验

4、方法-淋巴细胞增殖 试验 组织工程医疗产品 第16局部：保存指南组织工程医疗产品 第17局部：外源性因子评价指南组织工程医疗产品 第18局部：活细胞或组织的海藻酸盐凝胶固定或微囊指南组织工程医疗产品 第20局部:评价组织工程支架材料免疫反响的标准试验方法 -细胞迁移试验组织工程医疗产品第21局部：供体资质确定指南组织工程医疗产品 第22局部:人源细胞质量限制指南组织工程医疗产品 第23局部：组织操作标准组织工程医疗产品 第24局部：鼠胚实验本局部为组织工程医疗产品 第25局部为YY/T XXXX:动物源性生物材料DN峨留量测定法：荧光染色法本标准由国家食品药品监督治理局提出.本标准的归口单位为

5、中国食品药品检定研究院.本标准起草单位：中国食品药品检定研究院.本标准主要起草人：徐丽明、陈亮、邵安良.本标准20年 月 日首次发布.2YY/T XXXX.3,20XX引言由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性支架材料被普遍用于外科的创伤修复, 肌腱、皮肤、心血管、胃肠及下尿道组织的重建.这些细胞外基质支架材料取材于 人和动物的各种组织,如：猪的皮肤、角膜、小肠、尿道及膀胱,牛的皮肤、人的 皮肤等.由于细胞膜的表位抗原、同种异体或异种的DNAZ及由损1伤而来的小分子物质可能会引起人体广泛的免疫反响,因此动物源性支架材料的脱细胞过程被认为是非常重要的.尽管细胞外基质材料已经被广泛用于临 床,但仍然存

6、在由于残留DNAR残留蛋白质等所引起的炎症和免疫反响隐患.因 此,动物源性生物材料中,残留 DNAt量检测是限制产品质量的重要举措之一.国际上还没有对该类产品的残留 DNA佥测方法.目前,美国的FDA还没有对动物源性 生物材料残留DNA艮量的具体规定.我国已经出台了 “动物源性医疗器械产品注册 中报资料指导原那么食药监办械函2021519号,二？?九年十二月三十日.对动 物源性医疗器械产品注册申报资料的要求中提到,注册申报资料在满足一般性要求 的根底上,需要增加涉及限制病毒和/或传染性病原感染以及免疫原性风险方面有 关的技术内容.其中要求提供对消除或降低动物源性材料免疫原性工艺过程的描 述、质

7、量限制指标与验证性实验数据或相关资料.对于动物源性材料带来的免疫原 性风险的降低,一般采用在生产工艺中降低其免疫原性的方法,包括脱细胞、去除 杂蛋白,以及使蛋白质变性等物理的和/或化学的处理步骤,移走或覆盖抗原决定 簇.生产企业需对其降低材料免疫原性的有效性进行验证.其中验证手段之一就是 检测残留DN给量.但是,目前尚无适用于动物源性生物材料残留DNA勺定量检测方法.基于生物制剂残留DNA佥测方法主要包括DNAS针杂交法及荧光染色法 ?中国药典?2021,附录IX,B外源性DNA0t留量测定法,其中荧光染色法操作 简便、灵敏度高、再现性好,得到广泛使用.然而, ？动物源性生物材料来源于动 物或

8、人的组织主要是基质组织,经脱细胞等工艺制作而成,大多为固体状态 有 的为胶体或液体状态,不能直接采用上述方法检测；?基质组织中含有大量的结构 蛋白质,影响荧光测定的结果.所以,生物制剂残留DNA佥测方法不能直接用于动物源性生物材料残留DNA勺定量检测.本标准将阐述适用于动物源性生物材料残留 DNA勺定量检测方法.3YY/T XXXX.3,20XX动物源性生物材料DNA0t留量测定法：荧光染色法标准草案1范围1.1 本标准适用于动物源性包括人源性生物材料及其衍生物、用于组织工程 医疗产品基质或支架的动物源性支架材料.1.2 本标准所述试验方法用于动物源性生物材料的残留DNAt量检测.待检测样品的

9、DN岷留量在本标准所述方法的检测灵敏度之内的检测结果有效.针对每一 特定的样品,试验条件的设定是否合理需要有适当的方法学验证.除本标准所选方 法外,可采纳其他等效方法.1.3 实施本标准的使用者应建立相应的平安和健康条例,并规定治理条例的适用性.2标准性引用文件以下文件中的条款通过本局部的引用而成为本局部的条款.但凡注明日期的引 用文件,其随后所有的修改单不包括勘误的内容或修订版均不适用于本局部.然 而,鼓励根据本局部达成协议的各研究方可使用这些文件的最新版本.但凡不注明 日期的引用文件,其最新版本适用于本局部.GB/T16886.1-201X医疗器械生物学评价 第1局部：风险治理过程中的评价

10、与试验ISO10993-1:2021,IDTGB/T 16886.12-2005医疗器械生物学评价 第12局部：样品制备与参照样品 ISO10993-12:2002,IDTYY/T 0606.3组织工程医疗产品 第3局部：通用分类YY/T 0606.5组织工程医疗产品 第5局部：基质及支架的性能和测试GA/T 383-2002中华人民共和国公共平安行业行业标准：法庭科学DN骸验室 检验标准?无源植入性医疗器械产品注册申报资料指导原那么?食药监办械函 2021519号,二？?九年十二月三十日?动物源性医疗器械产品注册申报资料指导原那么?食药监办械函2021519号,二？?九年十二月三十日中华人民

11、共和国?药典?2021年版,第三部/附录？ B外源性DN颂留量测定法 ISO 22442-1:2007, Medical devices utilizing animal tissues and their derivatives3术语、定义及缩略词3.1 基质 matrix组织工程医疗产品中作为细胞或生物分子生长、支持或输送载体的原材料,可 以是高分子合成物质,也可以是生物组织的细胞外基质matrix来源的生物源性物质.3.2 支架 scaffold4YY/T XXXX.3,20XX促进替代、修复或再生组织的细胞或生物活性因子迁移、结合或输送的支持 物、释放载体或基体.许多有机物生物源性物质

12、、无机物及高分子物质都可以用 作组织工程医疗产品的支架材料.3.3动物源性生物材料biological materials来源于生物组织包括人源组织的各种基质,经脱细胞而制成的基质材料,可 以是固体状态枯燥型或湿润型、粉末状态、也可以是液体或胶体状态.1.4 不含 DNM解酶 DNase-free经过特殊处理,已证实不含 DN6解酶.本实验实施过程中所用的所有和样品 直接接触的离心管、吸头、移液管等器材均需保证不含DN吩解酶,以便预防样本中残留DNA解而不能正确地检测到.3.5 DEPC水DEPC treated water用DEPCdiethypyrocarbonate ,焦碳酸二乙酯处理过

13、并经高温高压灭菌的微 滤MiliQ纯洁水.经检测证实不含核酸分解酶RNase DNase剂蛋白分解酶(proteinase)DEPCK可以用于RNAC淀的溶解,含有RNA勺各种反响体系如反转录、siRNA的退火等,以及其它各种要求无核酸分解酶和蛋白分解酶的反响体 系.1.6 动物 animal任何脊椎或无脊椎动物,包括两栖动物、节肢动物如甲壳纲动物、鸟、珊瑚、鱼、爬行动物、软体动物和哺乳动物 不包括人智人.1.7 动物源性医疗器械 biological materials based medical devices某些医疗器械可能含有动物来源的材料,这些材料是多种多样的,可以构成该器械的主要部

14、件例如牛/猪源心脏瓣膜、羊肠缝合线、止血材料等、涂层或者浸 渗剂例如肝素、明胶、胶原等,也可成为生产过程中所用的辅助材料例如牛脂 等.1.8 衍生物 derivates通过制造工艺从动物源性材料中获得的物质.例如：透明质酸、胶原、明胶、单克隆抗体、壳聚糖、白蛋白等.1.9 化学交联 chemical cross-linking通过化学方法,如化学键的结合,使化合物呈现稳定状态.动物源性基质材料 多采用脱细胞处理和/或结合化学交联方法,到达移走或覆盖表位抗原、DN破损伤相关的小分子物质,从而减少和限制由这些残留物质引起的免疫原性风险.4 .实施标准概要4.1 本方法适用于各种来源于生物组织包括人

15、源组织的动物源性生物材料及 其衍生物的终产品或中问产品.4.2 对于由于生产工艺中采取了化学交联等工艺,终产品不能被酶类蛋白酶 K、胰酶等消化的样品,应使用化学交联等工艺前的半成品4.3 如果需要对化学交联后的终产品进行 DNM留量检测,可采用材料浸提液,而省略酶消化步骤,进行后续实验.但是,结果只能反映材料中的 DN峨留量和材料外表可能由于 污染造成的DNA5YY/T XXXX.3,20XX残留,不能代表被检品的实际 DNA残留量.此时应对浸提条件作具体规定.5.意义和使用5.1 本标准用于检测各种来源于生物组织包括人源组织的动物源性生物材料中残留的DN/量,以评价生产工艺中脱细胞处理是否完

16、全彻底.借此预测由残留DNA引起的免疫原性风险及DNA雨入变异的风险.5.2 通过本标准所述方法对残留DNA勺检测,间接地反映细胞残留物包括细 胞质内蛋白质及膜蛋白质的存在,以评价生产工艺中脱细胞处理是否完全彻底.借此预测残留细胞抗原 蛋白引起的免疫原性风险.5.3 应充分考虑本标准中方法的适用性和灵敏度.如果被检样品的残留DNA1很低,DNA屯化后的含量少于本方法的检出限时,应考虑使用其他方法 如实时定量PCRt.5.4 在实施本标准推荐的实验前,应考虑 GB/T 16886.1或治理部门所推荐的 方法文件所提示的信息,同时参考国内外研究的最新进展6 .实验方案和技术依据本试验方法所采用的实

17、验方案包括三个步骤:(1)动物源性生物材料的蛋白酶K 消化(适用于固体或胶体状材料)；(2)消化后样品的DNM化(磁珠吸附法);(3)纯化 后样品的DN岷留量测定(荧光染色法).试验样品除供试品之外,需同步设定回收 率试验样品(使用标准品Lambda DNA)技术依据：实验方案的设计依据以下参考文献,1)Badylak SF, et al. 2021, Seminars in12Immunology 20:109-116;2)Thomas W, et al. J Surg Res,2021,152(1): 135-139;3) 饶春明3等,药物分析杂志,2005,25(12):1417,141

18、9; 4) ?中国药典?2021版,第 三部,附录IX,B外源性DN峨留量测定法.注：因动物源性生物材料以胶原纤维等结构蛋白为主要组成成分,其对荧光染色法DNAW定有较强的干扰作用,因此本试验方法设定对供试品DNA故进一步纯化以排除干扰,保证精密度和回收率试验均符合要求.每次测定均应从一开始的蛋白 酶K消化步骤起增加回收率实验,并用回收率方程对测定结果进行校正.7(试剂和仪器6.1 试齐1J1(蛋白酶K消化用试剂：蛋白酶K(-20?保存,预防反复冻存和融化),蛋白酶K 缓冲液.2(DNA纯化用试剂：磁珠(4?保存)、裂解液、DNA吉合液、漂洗液、溶出 液(室温保存).注:？可选择使用核酸精制试

19、剂盒.本标准验证实验所用试剂盒为“PrepSEQTM Nucleic AcidExtraction Kit(PN 4400799, ABI) .其组成为:Lysis Buffer, Magnetic particles, BindingSolution, Wash Buffer Concentrate, Elution Buffer, Proteinase KBuffer, ProteinaseK?可选用其它同等效果的试剂盒,也可采用传统的酚氯仿抽提/乙醇沉淀法,但需要验证其回收6YY/T XXXX.3,20XX率、灵敏度及可重复性,保证能够满足实验的要求.3(荧光染色法检测试剂：PicoGr

20、een染料本标准验证实验所用试剂盒为“ Quant-IT PicoGreen dsDNA Reagent andKits (P7589,Invitrogen) .内含试齐：Quant-IT PicoGreen dsDNA reagent (component A);20 x TE (componentB); Lambda DNA standard (component C). 4. 其他试剂：回收率试验用标准品 Lambda DNA DEPC water 3% BSA6.2 仪器和器材?磁力架? 96孔板(黑色)?荧光酶标仪? DNase-free无菌离心管；吸头?冷冻离心机?震荡器?漩涡混悬

21、器?高精度天平(0.00001g)8试验过程注明：以下试验过程中必须采取预防 DNAase亏染的举措,如：戴手套操作、使 用没有DNAase亏染的专用实验台和实验用具及仪器.6.3 蛋白酶K消化6.3.1 供试品的准备?枯燥型样品：取供试品(?100 g g),精确称重并记录,放进1.5 mL DNase- free 无菌离心管内,用无菌眼科剪将样品剪裁成适当大小,加DEPCK至180L,于4?冰箱内放置12,24小时,使样品充分水和、软化.2?湿润型样品：取供试品(1 cm),放于1.5 mL DNase-free无菌离心管 内,13000 rpm/min离心10 min ,去除液体局部.另

22、取与上述同样大小的样品,分 别放于1.5 mL DNase-free 无菌离心管内,13000 rpm/min 离心10 min ,去除液体 局部后以开盖状态放在平安柜内,令其室温内自然枯燥24小时,枯燥程度的判定标准为-,然后精确称重并记录,用于样品干重单位重量内DN岷留量的计算.注明：在室温湿度较大,自然枯燥24小时不能使样品充分枯燥时,可将样品放在 37?枯燥箱内直至枯燥为止.?胶体型样品：精确量取供试品100 L,放于1.5 mL DNase-free无菌离心管 内,可直接进行下一步实验.注：胶体型样品：以单位体积的残留DN蛤量表示最终结果.?骨质类样品：对于诸如同种异体骨等骨植入物样

23、品应参照GA/T 383-2002中华人民共和国公共平安7YY/T XXXX.3,20XX行业行业标准-法庭科学DN骸验室检验标准,对供试品进 行脱钙处理.待脱钙完全,组织变软后再进行蛋白酶K消化处理.注:？每份样品设平行样三份,最终测定结果取其平均值?可以根据委托方的要求,取不同批号或同一批号的样品 3份,用以评价不同批次或同一批次内的工艺稳定性.将上述供试品剪成尽量小的碎片后,加蛋白酶K缓冲液(10 x Proteinase Kbuffer)20仙L,蛋白酶K (20 mg/mL)10 l L,力口 DEPOK至最终反响体积为 210仙 L.注：液态状样品不需要蛋白酶 K消化,可直接进行后

24、续的DNA屯化试验.6.3.2 回收率样品的准备取 DN雨准品(Lambda DNA standard)400ng、200ng、100ng、50ng、25ng、 0ng,用DEPOK稀释至100,分别加在1.5 mL DNase-free无菌离心管内,添 加蛋白消化酶K缓冲液20仙L,蛋白酶K(20 mg/mL) 10仙L, 3% BSA 80仙L(目的是 保证与供试品反响系统相同),至最终反响体积为210 nL.注明：标准品DNA羊品 系列浓度的设定应根据待检测样品 DN蛤量的大致范围(参照生产厂家的自检信息 或预试验结果),保证待检测样品DNAt量在回收率曲线样品DNA添加量的范围之 内.

25、8.1.3蛋白酶K消化将上述供试品和回收率样品分别混匀后放在56?水浴槽内消化,至待检测样品完全消化,无肉眼可见颗粒样物为止(消化所需时间因样品不同而异).注：以上反响条件及反响体积可依据样品特点进行优化、调整.6.4 DNA纯化依据所选择的方法及使用的试剂盒所附的操作方法进行DNA屯化.TMT阵例:使用 PrepSEO酸提取试齐盒(PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit)进彳T DNA屯化？在上述各样品中分别参加裂解液 400仙L,震荡10秒钟使样 品充分混匀,室温放置10min,使样品完全溶解(最多可放置1-2小时,直至样品完全溶解)?取出装有磁珠的离心管,

26、以“最大速度震荡10秒钟混匀后,取30L磁珠液分别参加上述各样品内,“低速震荡10秒钟混匀.?参加400叱L结合液异丙醇,震荡5秒钟.?室温下震荡1000 rpm/min孵育10分钟.?再次低速震荡10秒钟后,将内装样品的离心管放在磁力架上,收集结合有 DNA勺磁珠,去除上清液.？漂洗DNA参加300仙L洗液,低速震荡10秒钟后, 将内装样品的离心管放在磁力架上,收集结合有DNA的磁珠,去除上清液.?重复步骤？:漂洗DNA至少2次.?使结合有DNAB磁珠在室温下枯燥5分钟.?溶出DNA参加50L溶出液,中速震荡5分钟,于70度水浴槽内孵育5分 钟,中速震荡2秒钟后,将内装样品的离心管放在磁力架

27、上,别离 DNA8YY/T XXXX.3,20XX ?转移上消局部含有Z化 DNAg新的 1.5 mL DNase-free 无菌离心管内,标记为纯化后 DNA ?重复溶出DNA参加50仙L溶出液,重复？ -?,共2次?将三次溶出液充分混合,最终获得纯化 DNA总量150仙L.混匀后从中取出10 nL,用于凝胶电泳实验用于检测DNAt片的大小.注：纯化后的DNA羊品应立即使用或储存在适当的条件下-20?保存,保证其 在后续试验时的稳定性.应预防反复的冻存和融化.8.3 DNA含量测定荧光染色法用8.2中步骤？剩余的140 L纯化DNA羊品进行DN蛤量测定.? DNA标准曲线组样品的制备标准品溶

28、液的配制：用1 x TE缓冲液将DNAfc准品配成0/mL、2.5ng/mL、 5ng/mL、10ng/mL 20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL的标准品溶液各 400iL.将稀释好的标准品溶液125仙L参加96孔黑色酶标板内,每份样品设3个复 孔.?回收率实验样品及供试品的制备取回收率实验DNA屯化样品和供试品DNA屯化样品各10-40八,参加1 X TE 缓冲液390-360 nL,得至IJ 40-10倍稀释液400仙L,取125仙L参加到96孔黑色酶 标板内,每份样品设3个复孔. 注明：回收率实验DNA屯化样品和供试品DNA屯化 样品的稀释倍数可以调整,应尽可能保证其反响后吸光

29、度值在标准品溶液反响后吸 光度值范围内小于80 ng/mL反响后吸光度值.?分别于上述各样品中添加 PicoGreen反响液125仙L与样品等体积混合,震荡混匀后室温避光反响 5min 后,用荧光酶标仪测定.测定条件：以480 nm为激发波长,以520 nm为发射波 长,以530nm为截止波长进行测定,以所得数据彳图分析并求得回归方程.以 1 x TE缓冲液为样品测得的荧光强度值为本底,测定和记录各测定孔的荧光值OD值.注:？ 该荧光测定法 DNAft出BM为0.3 ng/mL.DN给量在1.25-80 ng/mL 范围 线性较好,因此供试品DN给量在该范围内可定量测定 *DNAt量低于1.2

30、5 ng/mL时应为限量测定,表示为小于1.25 ng/mL ,此时应减少样品的稀释倍数后重 新测定.？ PicoGreen反响液：由PicoGreen原液以1 x TE Buffer稀释200倍配 制.？ 1 x TE Buffer:由 20X TE Buffer 以 DEPCK稀释配制.9结果计算?首先对标准品和回收率试验样品及供试品进行5次重复测定,获得ODfi;取五次测定的OD值平均数,并减去本底(只有TE,无DNA寸测彳4的ODfi);?利用标准品测定值(OD值)为纵坐标(y),添加量(ng/ml)为横坐标(x),绘制 标准曲线,获得回归22 方程:X = (Y-a1)/b1, R;

31、R 应大于 0.99.?将回收率试验DNA屯化样品和供试品DNA屯化样品所测得的OD值分别减去 回收率试验“ 0ng样品的OD值,再分别代入回归方程的y,求得各样品的x,即为DN给量的实测值(C: ng/ml); ? 将此实测值(C: ng/mL) X测试前的反响体积(V: 0.4 mL),获得实测 DN颇量(M: ng);9YY/T XXXX.3,20XX ?因纯化后样品为150 L,其中10-40仙L用于DN*量测 定,故实测 DNAW量(M: ng)/10-40 L X 150L L为纯化后样品的DN*量(M: ng); post?用回收率样品的纯化前初始添加量(M)和纯化后样品的DN给

32、量(M)制作回收 率曲线,获得回 prepost2收率曲线方程M = (M-a2)/b2, R;并计算各回收率样品的回收率.prepost?将供试品纯化后样品的DN给量(M: ng)代入回收率曲线方程,求得纯化前 DNASI留量(M:校 postpre正值)；?最后用校正值除以样品干重量,即可得到供试品单位重量(mg)的DN峨留量.10结果判定210.1回收率曲线方程的相关系数 R应大于0.96;最低回收率应不低于60%10.2 以供试品单位重量mg的DNA含量为最终的DN峨留量,报告实际检测数值.10.3如果最小稀释倍数条件下的荧光测定值低于最低检测限1.25 ng/mL的荧光值时应为限量测

33、定,表示为小于1.25 ng/mL.10.4 本试验方法中回收率试验最低样本量为 6.25 ng DNA,低于6.25 ng时回 收率明显下降,不能满足良好的准确性和精密度.因此,本试验方法中适宜的样本量为?6.25 ng DNA/样品.假设样品中DNA残留量低于6.25 ng DNA/样品时,应加大样品的取样量,同时相应地扩大蛋白 酶K消化时的反响体积.如果在最大取样量的条件下仍不能满足上述条件,那么只能报告未经回收率校正 的检测值作为参考资料,此种情况在最终报告中应注明.11讨论-生物材料残留DNA艮量目前国际上尚无具体生物材料残留 DNA勺限量标准.美国的FDA也还没有对生 物来源的生物

34、材料残留DNA艮量的具体规定.4-9国际上许多机构对疫苗DN峨留发布了指南并制定了相关标准,如:WHO1986规定DN喊留-1-1不能超过100 pg?人份剂量;WHO1998规定DN喊留不能超过10 ng?人份剂量；FDA1997年-1-1规定DN岷留不能超过10pg?人份剂量；我国规定DNM留不能超过100 pg?人份剂量.Lebron JA等-1在研究报告中建议,口服疫苗 DN岷留不能超过100 g?人份剂量.针对具体的动物源性生物材料产品制定残留 DNA勺限量标准时,宜结合对不同生物材料的来源、加工工艺和临床应用特点的综合风险评估以及风险/受益比的分析,制定科学合理的限量标准.10YY/T XXXX.3,20XX参考文献1 Badylak SF, et al. Immune response to biologic scaffold materialsJ. Seminars in Immunology 2021, 20:109-116.2 Thomas W, et al. Quantification of DNA in biologic scaffold materialJ. Journal of Surgical Research 2021, 152:135-139.3饶春明等,应用荧光法测定重组细胞因子中剩余DNAt量J.药物分析杂志,2005,25(12