温度及循环参数——PCR反应条件优化（一）

1、温度及循环参数pcr反应条件优化（一） (一)温度与时光的设置 基于pcr原理设置变性、退火、延长三个温度点。在标准反应中采纳三温度点法，双链dna在9095变性，再快速冷却至4060，引物退火并结合到靶序列上，然后迅速升温至7075，在taq dna聚合酶的作用下，使引物链沿模板延长。对于较短的靶基因(长度为100300bp时)可采纳二温度点法，除变性温度外，退火与延长温度可合二为一，普通采纳94变性，65左右退火与延长(此温度下taq dna酶仍有较高的催化活性)。 1变性温度与时光 模板dna和pcr产物变性不充分是pcr失败的主要缘由。dna在其链分解温度tm时的变性只需几秒钟，但反应

2、管内达到丁。还需一定时光，变性温度过高会影响酶活性。普通状况下，9394min足以使模板dna变性，相宜的变性条件是95×30s，或97×15s，若低于93则需延伸时光。用法较高的温度是相宜的，特殊是对g+c比较丰盛的模板序列。变性不彻低，dna双链很快复性，因而削减产量。在变性中，温度过高或反应时光过长，对酶的活性有影响，有可能导致酶活性损失，此步若不能使靶基因模板或pcr产物彻低变性，也会导致pcr失败。为提高起始模板的变性效果，保存酶活性，经常在加入taq酶之前95先变性710min，再按94的变性温度进入循环方式，这对pcr胜利有好处。taq dna聚合酶活性半衰期

3、在925为2h以上，95为40min，97为5min。 2退火温度与时光 退火温度是影响pcr特异性的较重要因素。变性后温度迅速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。因为模板dna比引物复杂得多，所以引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时光取决于反应体系的基本组成及扩增引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。实际用法的退火温度要比扩增产物在pcr条件下的真切tm值低5。对于20个核苷酸，g+c含量约50的引物，55为挑选最适退火温度的起点较为抱负。taq dna聚合酶的活性温度范围很宽，退火温度在5572会得到好的结果。在典型的引物浓度时(如02m

4、oll)，退火仅需数秒即完成。如增强退火温度会增加对不正确的退火引物的识别，同时能降低引物3端不正确核苷酸的错误延长。因此，严格规定退火温度，特殊是前几个循环中，会增强扩增的特异性。为了在开头循环中就获得最大的特异性，应在第一次变性之后、引物退火之前加入taq dna聚合酶。假如退火温度低，dntp的浓度高，简单使引物错误延长。因此，一些pcr的讨论者建议pcr的扩增用法两种温度范围效果较好，5575为退火和延长温度，9497为变性温度。 引物的复性温度可通过下列公式协助挑选： tm值(解链温度)=4(g+c)+2(a+t) 复性温度=tm一(510) 在tm值允许范围内，挑选较高的复性温度可

5、大大削减引物和模板间的非特异性结合，提高pcr反应的特异性。复性时光普通为3060s。 3延长温度与时光 taq dna聚合酶虽能在较宽的温度范围内催化dna的合成，但不合适的温度仍可对扩增产物的特异性、产量造成影响。pcr反应的延长温度普通挑选在7075(较复性温度高10左右)，此时taqdna聚合酶具有最高活性，但常用温度为72，温度过高不利于引物和模板的结合。 延长反应的时光长短取决于模板序列的长度和浓度以及延长温度的凹凸。在最适温度下，核苷酸的掺人率为35100nts，这也取决于缓冲体系、ph、盐浓度和dna模板的性质等，普通1kb以内的dna片段，延长1min；34kh的靶序列需34

6、min；扩增10kb则需15min。延长时光过长会导致非特异性扩增带的浮现，但在循环的最后一步延长时，为使反应彻低，提高产量，可将延长时光延伸410min。假如底物浓度十分低时，较长的扩增时光对初期循环是非常有利的，在稍后的循环中，当扩增产物的浓度超过酶的浓度(约1moll)时，dntp削减，适当增强引物延长时光对扩增有较好的协助，所以最后一轮延长时光常定为57min。 (二)循环次数 循环次数打算pcr扩增程度，而pcr循环次数主要取决于模板dna的浓度；普通的循环次数在3040次，此时pcr产物堆积即可达到最大值，刚刚进入“平台期”。即使再增强循环次数，pcr产物量也不会再有显然的增强。“平台期”是指pcr后期循环产物的对数堆积趋于饱和，并陪同031pmol靶序列的累计。随着循环次数的增强，一方面因为产物浓度过高，以致自身相结合而不与引物结合，或产物链缠结在一起，导致扩增效率降低；另一方面，随着循环次数的增强，taq dna聚合酶活