老年肺癌患者外周血单个核细胞hTERT基因表达

1、老年肺癌患者外周血单个核细胞hTERT基因表达【关键词】 肺肿瘤 Expression of human telomerase reverse transcriptase gene in peripheral blood mononuclear cells of lung cancer in elderly patients【Abstract】 AIM: To investigate the significance of the expression levels of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene in periph

2、eral blood mononuclear cells of lung cancer in elderly patients. METHODS: The expression levels of hTERT were detected in 20 elderly patients with lung cancer and 10 normal elderly subjects by quantitative measurement with RTPCR. RESULTS: The expression levels of hTERT mRNA in the lung cancer patien

3、ts (0.927±0.115) were significantly higher than those in normal subjects (0.408±0.124, P<0.001), without significant correlation with pathological types and clinical stages. CONCLUSION: The quantitative measurement with RTPCR for the expression levels of hTERT mRNA is an effective m

4、ethod in the diagnosis of lung cancer in patients who are not fit for other examinations.【Keywords】 aged; lung neoplasms; human telomerase reverse transcriptase; gene expression【摘要】 目的： 探讨外周血单个核细胞(PBMCs)的人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的表达水平对于老年肺癌的诊断意义. 方法： 采用RTPCR定量检测20例老年肺癌患者及10例正常老年人外周血单个核细胞的hTERT的基因表达水平. 结果： 老

5、年肺癌患者hTERT mRNA的水平明显高于正常对照组（0.927±0.115 vs 0.408±0.124, P<0.001）. 与病理类型与临床分期无相关性. 结论： 定量测定PBMCs的hTERT mRNA的表达水平是诊断不适合其他检查的老年肺癌患者的有效方法.【关键词】 老年人；肺肿瘤；人端粒酶反转录酶；基因表达0引言老年疑似肺癌患者的明确诊断一直是长期困扰临床医生的实际问题. 端粒酶可作为一种肿瘤标记物已在多组研究中被证实. 我们研究的目的是探讨外周血单个核细胞(PBMCs)的人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的表达水平对于老年肺癌的诊断意义.1对象

6、和方法1.1对象200201/200412我院住院的老年肺癌患者20例，男15例，女5例，年龄6182（70±6）岁. 患者依据病史、临床表现、XRay胸片、肺CT，纤支镜、癌细胞学及病理学确诊（Tab 1）. 正常对照10例，均为来我院健康体检者，男7例，女3例，年龄6281（71±5）岁，经健康检查均除外各种恶性肿瘤.1.2方法1.2.1标本采集两组人群于清晨06：0007：00空腹未起床活动时，平卧位采取右肘静脉血3 mL，肝素抗凝, 加入等量的PBS液稀释混均，加至5 mL淋巴细胞分离液上，4离心（2000 r/min, 15 min），吸取中间层单个核细胞，-80

7、保存待检测.1.2.2总RNA提取上述细胞利用总RNA的提取系统(II)(total RNA Extraction system II,华美生物工程公司)来提取总的RNA，实验步骤按说明书进行. 将沉淀的RNA进行干燥，用无RNase污染的水将RNA溶解，在A260280测吸光值，要求A260/2802.0并计算出RNA含量，并用其合成cDNA.1.2.3引物构建端粒酶hTERT引物从Lternet GenBank中调出hTERTmRNA全基因系列，采用primer5.0计算机软件设计引物，上游引物5TAT GCC GTG GTC CAG AAGG3,下游引物5GCG TGG GTG AGG

8、TGA GGTCT3, 扩增长度为328 bp. 内参照(actin)上游引物为5GAT TGC CTC AGG ACA TTT CTG3, 下游引物5GCG TGG GTG AG TGA GGT CT3, 扩增片段长度为690 bp, 引物由北京奥科合成. 1.2.4cDNA合成应用RTPCR试剂盒（大连宝生物有限公司）逆转录合成cDNA. 每个反应体系中加入总RNA 1 L, 2×buffer 5 L, MgSO4 2 L, dNTPs 0.5 L, AMV(逆转酶) 0.5 L, oligodT15 0.5 L, RNaseinhibitor 0.25 L, dd.H2O 0.

9、25 L. 将上述反应物放入PCR仪(BIOMETRA型)65 1 min30 5 min, 30至65 1530 min匀速升温，65 30 min98 5 min5 5 min，合成好的cDNA存于-20备用.1.2.5内参照定量PCR在PCR反应体积中，吸取cDNA 1 L; dd.H2O 9.5 L; 10×buffer 1.25 L; dNTP 1 L; Taq酶0.1 L; hTERTR 0.1 L; hTERTf 0.1 L. 放入PCR仪内扩增，反应条件为93预变性3 min94, 45 s57.6, 1 min72 1 min，共35个循环.1.2.6PCR产物检测

10、取10 L hTERTmRNA的PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳（电泳仪为： DYYIII33A型）， 在紫外凝胶扫描仪观察拍照，并存入1D Kadak成像分析系统，分别计算出端粒酶hTERTmRNA基因和actin基因的峰体积，计算出它们的比值. 统计学处理: 数据用x±s表示，用SPSS10.0统计软件包进行单因素的方差分析与方差的齐性检验.2结果 老年肺癌患者PBMCs的hTERTmRNA 的水平为0.927±0.115，对照组的PBMCs的hTERTmRNA的水平为0.408±0.124，两者比较有差异有统计学意义(P<0.01),

11、 电泳见明显分带（图1）. 在20例肺癌患者中小细胞癌5例，磷癌6例，腺癌9例；hTERTmRNA的表达与病理类型和分期无相关（表1）.表1临床分期和病理类型与肺癌患者外周血hTERTmRNA的表达(略)3讨论端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，是一种专一的逆转录酶，能以自身的RNA为模板从头合成端粒酶以补偿细胞分裂时染色体末端缩短，维持端粒不变，保持染色体的动态平衡1. 近年研究表明端粒酶的活化在细胞癌变中发挥重要作用2. 由于端粒酶的活化，使端粒的长度维持一种动态平衡，细胞得以无限制的繁殖下去，导致肿瘤的发生.目前测定端粒酶的活性主要采用Kim等3建立得以PCR为基础的TRAP法. 陈杰4对47

12、例肺癌及其相应的癌旁组织进行端粒酶活性及hTERTmRNA的检测，结果肺癌组织端粒酶活性及hTERTmRNA表达均高于癌旁组织. 我们的实验结果表明，老年肺癌患者PBMCs的hTERTmRNA水平明显升高, 结果与文献报道的相似. 说明端粒酶在肺癌的发生发展中可能起到某种重要的作用. hTERTmRNA的表达与病理类型和临床分期无相关性，与文献结果一致5；在此方面的研究中存在一些争议，有待扩大样本作进一步研究. 肿瘤细胞端粒酶激活是一种反应模式，这是一种不依赖于端粒长度的酶激活模式. 其认为肿瘤细胞主要来自端粒酶阴性的前体细胞只有当端粒酶缩短到一定程度后才会激活端粒酶，因此这在肿瘤的发生中是晚

13、发事件，大多数实体肿瘤即以这种模式保持端粒酶活性6. 因此，我们认为此过程可能成为肺癌端粒酶的激活途径.【参考文献】1 Wu TC, Lin P, Hsu CP, et al. Loss of telomerase activity may be a potential favorable prognostic marker in lung carcinomas J. Lung Cancer, 2003,41(2):163-169.2 Lantuejoul S, Soria JC, MoroSibilot D, et al. Differential expression of telomerase reverse transcriptase (hTERT)in lung tumours J. Br J Cancer, 2004,90(6):1222-1229.3Kim NW, Piatysezk MA, Prowes KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer J. Science,