益气化淤中药对大鼠胃癌前病变蛋白激酶C蛋白表达的影响

1、益气化淤中药对大鼠胃癌前病变蛋白激酶C蛋白表达的影响【摘要】 目的观察益气化淤中药对大鼠胃癌前病变胃黏膜蛋白激酶C（PKC）表达的影响。方法采用MNNG、乙醇、饥饱失常等多因素造模。造模型成功后，将造模存活大鼠随机分为自然恢复组，中药高、中、低剂量组, 各组大鼠作相应的处理后, 免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜组织PKC表达水平。结果各治疗组PKC表达较自然恢复组下调,有显著性差异(P<0.05)。结论益气化瘀中药可能是下调PKC的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，而发挥对大鼠胃癌前病变的治疗作用。 【关键词】 胃癌前病变 蛋白激酶C 益气化淤中药Abstract：ObjectiveTo o

2、bserve the effect of Yiqi Huayu Recipe on the expression of protein kinase C(PKC) in rats with gastric precancerous lesions(GPL).MethodsThe model of GPL was established mainly through N-methyl-N-nitro N-nitrosoguanidine (MNNG) together with other factors including alcohol stimulation and undue hunge

3、r and overeating. The survived rats after modeling were randomly divided into spontaneous recovery, and high-, moderate-and low-dose of Yiqi Huayu Recipe group. After the corresponding treatment, the expression of PKC was detected by immunohistochemical method. ResultsThe expression of PKC in each t

4、reatment group were distinctly lower than that in spontaneous recovery group (P<0.05).ConclusionYiqi Huayu Recipe is effective in the treatment of rats with GPL by inhibiting the expression of PKC.Key words：Gastric precancerous lesions; Protein kinase C; Yiqi Huayu Recipe 慢性萎缩性胃炎（CAG）伴中重度不典型增生或/和

5、不完全性结肠型化生是胃癌的重要癌前病变。益气化淤中药临床治疗胃癌前病变取得了很好的治疗效果1，为了探讨其作用机制，特设计本实验，现报道如下。1 材料与方法1.1 药物及试剂甲硝基亚硝基胍(MNNG)为Fluka公司产品，每周用双蒸水配成1 g/L的母液4避光储存，临用时用双蒸水配成所需浓度；脱氧胆酸钠购自湖北省医药公司；雷尼替丁由杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产；PKC小鼠抗大鼠单克隆抗体为SantaGruz 公司产品；生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗)、辣根酶标记链亲合素(三抗)、DAB、封闭用山羊血清等为博士德试剂公司产品。益气化淤中药主要由太子参、石斛、三七、郁金、白花蛇舌草等组成，

6、浓度2 gml。1.2 造模及给药方法选用SPF级6周龄SD大鼠62只，体质量100120 g。造模参照严茂祥等26综合造模方法并加以改进。大鼠自购进后适应性喂养1 d。从62只大鼠中随机抽取13只作为正常组, 其余49只用于造模。正常组大鼠不做任何处理；造模大鼠每日自由饮用100 mg/L MNNG液(饮料瓶用油漆涂黑避光)、进食含0.3 g/L雷尼替丁的纯鼠饲料、上午用56 150 g/L的氯化钠液按10 ml/kg灌胃，进食2 d，禁食1 d，进食当天下午用8.5 g/L脱氧胆酸钠溶液按10 ml/kg灌胃。禁食当天下午用400 ml/L乙醇按10 ml/kg灌胃，连续24周。24周末时

7、随机抽取正常组和造模大鼠各1只，杀检，观察组织病理学变化(以HE染色光学显微镜下观察的结果为主)，确认模型是否成功。造模型成功后，将造模存活的48只大鼠随机分为自然恢复组12只。中药高、中、低剂量组(简称高、中、低剂量组)各12只。高剂量组每日每只按20 g/kg(相当于成人1 d用量的两倍)灌胃，中剂量组按10 g/kg(相当于成人1 d用量)灌胃，低剂量组按5 g/kg(相当于成人1 d用量的50%)灌胃。上述治疗16周。自然恢复组同正常组大鼠常规饮食。40周末所有动物禁食1 d，处死，剖腹取胃，沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗，肉眼观察，平铺于硬纸板上，于胃窦部剪取组织1块，40 g/L多聚甲

8、醛固定，石蜡包埋, 切片5 m, 免疫组织化学染色。1.3 PKC蛋白表达PKC一抗稀释倍数(1100)，染色步骤如下:切片脱蜡入水。3%H2O2室温孵育1 min,以灭活内源性酶。最后蒸馏水洗3次。将切片浸入TAB(0.05 mol/L，pH7.4)中,电炉加热至100,持续30 min。冷却后进行下一步。滴加抗原修复液,室温孵育10 min，蒸馏水洗3次。滴加正常5%山羊血清封闭液,室温孵育10 min，甩去多余液体。滴加稀释的一抗,4湿盒内过夜。TAB洗涤3次,每次5 min,滴加二抗室温孵育30 min。TAB洗涤3次，5 min/次，滴加三抗(HIGH-SABC)室温孵育30 min

9、。TAB洗涤3次，5 min/次，DAB显色。自来水冲洗，苏木复染，封片。1.4 观察方法及判断标准根据文献7加以改进。切片中出现黄染为阳性。每张切片由两位观察者独立计数,随机取染色区域4个高倍视野(400)阳性细胞平均数,用半定量计分。染色强度用03级计分：0级为无染色；1级为轻度阳性染色；2级为中度阳性染色；3级为强阳性染色；染色范围根据细胞阳性染色的百分数而分为04级：0级为无染色；1级为510细胞染色；2级为1020细胞染色；3级为2050细胞染色；4级为>50细胞染色。染色总评分为染色强度+染色范围。1.5 统计学处理方法数据用s表示, 组间差异性比较采用q检验，P<0.

10、05认为有显著性差异。2 结果 PKC在正常组中主要存在于胞浆,其他组别中,除了胞浆外，在胞膜和胞核也可见。自然恢复组较对照组PKC表达增强,有非常显著性差异(P<0.01)；各治疗组较对照组PKC表达增强,但没有显著性差异(P>0.05)；各治疗组较自然恢复组PKC表达下调,有显著性差异(P<0.05)；各治疗组之间比较没有显著性差异(P>0.05)。结果见表1。表1 各组大鼠的PKC蛋白表达(略)3 讨论蛋白激酶C(PKC)是1977年由日本学者Nishizuka等8首次在鼠脑的胞质成分中发现的一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶,其广泛分布于真核细胞中,由多种具有不同生物学

11、特性的同工酶组成,是细胞内信号传导的重要递质。PKC通常处于失活状态,被激活后可由细胞质转位到细胞膜,能够使众多蛋白质中的丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化而发挥作用。PKC的活化不仅与正常细胞和异常细胞的生长、分化、凋亡等多种生物学效应有关， 更在肿瘤的发生、发展、转移和多药耐药等方面发挥重要作用。有人采用不同浓度的PKC抑制剂Staurosporine(ST)作用于人胃癌细胞株MGC 803和SGC 7901后,细胞增殖受到明显抑制,表明PKC在胃癌细胞增殖中具有重要作用9。胃癌细胞增殖时,PKC活性表现为上调趋势,而诱导胃癌细胞凋亡时,它表现为下调趋势1012，一些化疗药物和抑制增殖及诱导凋亡的药

12、物如特异性环氧化酶 2抑制剂也通过下调PKC活性而抑制胃癌细胞生长13，14。本实验结果表明，以MNNG为主的多因素联合攻击法诱发的大鼠胃癌前病变(自然恢复组)粘膜PKC蛋白表达明显增高，胃炎消能使PKC蛋白表达明显下降(与自然恢复组比较，P<0.05)，我们推测胃炎消可能是通过下调PKC的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，而发挥对大鼠胃癌前病变的治疗作用。【参考文献】 1胡 玲，黄志新.劳绍贤医学文选M.广州：广东科技出版社，2005：201.2严茂祥, 陈芝芸, 项柏康,等. 大鼠胃黏膜癌前病变模型的建立J.浙江中医学院学报，1998,22: 3.3李春启, 刘为纹, 房殿春. 甲硝

13、亚硝胍和/或雷尼替丁诱发大鼠腺胃黏膜肠上皮化生J.胃肠病学和肝病学杂志，1995，4（4）: 254.4石宇, 李连宏. 复合因素诱发大鼠胃黏膜癌前病变的动物模型J.临床与实验病理学杂志，2000， 16: 406.5ThompsonC B.Apoptosis in pathogenesis and treatment of diseaseJ.Science, 1995,267:1456.6Potten CS,Booth C.The role of radiation induced and spontaneous apoptosis in the homestasis of thegastr

14、ointestestinal epithelium: a brief reviewJ.Comp Bioche m Physiol Bioche m Mol Biol, 1997,118:473.7Klein IK, Ritland SR, Burgart LJ, et al. Adenoma-specific alterations of protein Kinase C is ozyme expression in Apc(MIN) miceJ.Cancer Res,2000,60(8):2077.8Nishizuka Y, Takai Y, Kishimoto A, et al. A ro

15、le of calcium in the activation of a new protein Kinase system. Adv cyclic Nucleotide ResJ.1978,9:209.9哈敏文，侯柯佐，刘云鹏，等.蛋白激酶C抑制剂Staurosporine对人胃癌细胞周期的影响J.癌症,2003,22(7):691.10邢承忠,陈峻青.胃癌细胞凋亡过程中PKC活性表达的变化J.中国医科大学学报,1999,28(1):25.11UchidaN,OkamuraS,KuwanoH.Protein kinase C activity in human gastric carcino

16、maJ.Oncol Rep,2000,7(4):793.12Izawa M,Teramachi K.Down-regulation of protein kinase C activity by sorbitol rapidly induce sapoptosis in human gastric cancer cell linesJ.Apoptosis,2001,6(5):353.13Jiang XH,Lam SK,Lin MC,et al.Novel target for induction of apoptosis by cyclo-oxygenase-2 in hibitor SC2236 through aprotein kinaseC beta(1) depen