试验1大肠杆菌的培养和分离

1、实验1大肠杆菌的培养和分离基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌 无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同， 细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。 革兰氏阳性菌细胞壁 厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产 生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大 肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工 程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工 程中常用的受体细胞。二、培养基配置微生

2、物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物 既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有 机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上 述几种主要营养物质的基础上， 培养基还需要满足微生物生长对 ph、 特殊营养物质以及氧气的要求。我们一般用lb液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在lb固体培养基上划线分离。以下为本来源网络整理，仅供供参考实验中培养基配置步骤：1 .称量：准确称取各成分。蛋白月东0.5g,酵母提取物0.25g,氯化钠0.5g,加水50ml。配置lb固体培养基时还需加1g琼脂。 2.溶化：加热熔化，用蒸储水定容到

3、 50ml。配置lb固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。3.调ph：用1mol/l naoh溶液调节ph至偏碱性。 4.灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml lb液体培养基和50ml lb固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。5.倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60c左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖

4、上皿盖；待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌的培养基时， 也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。三、灭菌和消毒1.无菌技术：对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具来源网络整理，仅供供参考 和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接 触。 2.消毒方法：日常生活经常用到的是煮沸消毒法；对 一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；对接种室、接种箱或超 净工作台首先喷

5、洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用 紫外线进行物理消毒；实验操作者的双手使用酒精进行消毒。3 .灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；培 养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。4 .比较消毒和灭菌：共2页，当前第1页12 比较项 理化因 素的作用强度消灭微生物的数量芽抱和抱子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能 灭菌强烈全部微生物能 5.注意事项：实验中用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。灭菌后，通常在6080c烘箱中除去灭菌时的水分；物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌

6、后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是有利 于锅内温度升高，随后关闭排气阀继续加热，加热结束切断热源后， 要使温度自然降低，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防止容器来源网络整理，仅供供参考中的液体暴沸；在用任何器皿转接时，瓶塞和封口膜只能夹在手上， 不许放在台面上，接种时要在酒精灯火焰旁操作；培养基一定不能 沾在三角瓶口、试管管口和培养皿壁上，否则容易污染；接种时要 胆大心细，动作快捷，这是减少污染的关键；接种后，培养皿必须 倒放（盖在下方）在恒温培养箱中，如正放则水蒸气在盖上凝成水滴， 滴到接种后的培养基表面，水流扩散会使菌落扩散，就很难形成单菌 落了。 四、细菌的分离 1.

7、划线分离法：用接种环蘸菌液后 在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少， 细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养10 20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌 落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上， 在斜面上划线，则每个 斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。具操作步骤是：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。 在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内， 在平板培养基的一边，作第1次平行划线35条,转动培养皿约70。 角，用烧过冷却的接种针，通过第 1次划线部分作第2次平行划线， 然后

8、再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通 过第三次平行划线部分作第四次平行划线。 划线时，接种针应与平板来源网络整理，仅供供参考表面成30角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养 基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼 烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。2.涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到10- 510 7之间，然后取0.1ml 不同稀释度的稀释菌液放在培养

9、皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌 落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分 别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。细菌的两种 分离法各有优点，都可采用。五、菌落和菌种种类的辨认单个细菌用肉眼是看不见的，但是，当单个或少数细菌在固体培养基上 大量繁殖时，便会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞 群体，叫做菌落。不同种类的细菌所形成的菌落在大小、形状、颜色、 光泽度、透明度等方面具有一定的特征。细菌的菌落表面一般是光滑而湿润的，有黏稠性，多数透明或半透明，但也有细菌的菌落表来源网络整理，仅供供参考面是干燥、有褶皱的；放线菌由于有纤细的菌丝并可产生抱子，所以 菌落表面是紧密的绒状、坚实多皱，长抱子后就成粉末状，由于菌丝 和抱子有多种色素，所以在菌落培养基底部和菌落表面都有不同的颜 色，菌落不易用接种环挑动；酵母菌落类似于细菌菌落，表面光滑而 湿润，有黏稠性但大多呈乳白色，少数呈红色。如果菌落无