菌龄对核盘菌致病性的影响及植物抗核盘菌分子机制

1、菌龄对核盘菌致病性的影响及植物抗核盘菌分子机制核盘国（sclerotinia sclerotioru）行）是一一种在世界范围内广泛分布的死体营养型病原真菌。核盘菌引起的菌核病是油料和蔬菜作物的重要病害。草酸和细胞壁降解酶是核盘菌重要致病因子。核盘菌生长过程中当遇到不利 条件时会产生气生菌丝并形成菌核，核盘菌菌丝形态的分化使其致病力发生很大 变化。但具体机制尚不清楚。目前对植物抗核盘菌机制的理解仍很肤浅，抗核盘菌调控新基因的鉴定急需开展，作为核盘菌的非寄主植物的水稻与核盘菌的互作或 许会为核盘菌抗性研究提供新的发现。本研究围绕植物与核盘菌的互作机理，解析菌龄影响核盘菌致病力的分子机 制、阐明植物

2、钙离子信号通路在抗核盘菌中的作用、采用本氏烟cDNAC库-VIGS筛选技术，获取抗核盘菌调控新基因，并初步揭示水稻与核盘菌的非寄主互作分 子机制，获得了如下结果：（1）明确了核盘菌菌丝形态分化与致病力的关系，解释 了富含气生菌丝的老熟菌丝致病力下降的原因。核盘菌平板培养时老熟菌丝上会 有大量气生菌丝产生，显微观察发现气生菌丝直径明显比幼嫩菌丝小，只有幼嫩 菌丝的1/5左右。与新生菌丝（菌龄为0d的幼嫩菌丝）相比,1d-3d菌龄的老熟菌丝致病力明显 下降。进一步分析显示，老熟菌丝中草酸合成关键基因OAH勺表达明显低于幼嫩 菌丝，而且老熟菌丝产草酸的能力显著下降。外源施加草酸（10mM,pH7.0

3、）部分恢复老熟菌丝的致病力。这些结果证明草酸 分泌的降低导致了老熟菌丝致病力的下降。此外,1d-3d老熟菌丝中超氧阴离子和过氧化氢含量低于0d菌龄的菌丝，这与活性氧代谢相关基因的表达结果相对应。另外，RNAi分析结果表明，微管相关 蛋白EB1基因的沉默减弱生长发育和菌核形成，致病力也明显下降。显示EB1基因在核盘菌生长发育、菌核形成和致病性中的重要作用。(2)揭示了钙离子信号途径和 AtWRKYI基因在植物抗核盘菌中的作用。采用芯片表达谱技术比较分析了接种核盘菌前后油菜叶片的基因表达谱，发现有1072个差异表达在2倍以上的基因，其中接种后上调表达基因531个，下调 表达基因541个。差异表达基

4、因中有15个与钙离子信号通路相关。药理学研究结果显示，钙离子通道抑制剂氯化锢(LaCl3,1mmol/L)和钙泵抑 制剂偏铀酸钠(NaVO3,50 mol/L)处理降低了本氏烟对核盘菌的抗性，而 CaCl2(10mmol/L)处理则增强该抗性。这些调节剂的处理显著诱导包括 AtWRKY11 在内的一组钙离子信号传导基因的表达。拟南芥wrkyll突变体对核盘菌抗性显著下降。这些结果证明了钙离子信号 通路对植物抗核盘菌起重要调控作用。(3)在基因组水平鉴定了番茄钙离子依赖的蛋白激酶(Calcium-dependentprotein kinase,CDPK) 和 CDPK-related prote

5、in kinase (CRK) 基因家族，并采 用病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing, VIGS)技术分析明确了SlCDPKffi SlCRK基因对核盘菌抗性的重要调控作用。采用生物信息学方法鉴定 了 29个番茄CDPKS因和6个CRKSI3。所有SlCDPKS白都包含一个STKc_CAMK丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域和 两个EF-hand类钙离子结合结构域，所有SlCRK仅仅在N端包含一个STKc_CAMK 类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，而C端不含有保守的Ca2+吉合位点。系统 进化分析发现番茄CDPKC族分为4个组。其中第IV组SlCDPKs比

6、较特珠，它们是碱性蛋白并有11个内含子。VIGS分 析显示,SlCRK6同时参与了对核盘菌和 Psedomonas syringae pv. tomato DC3000(Pst DC3000方勺抗性调控；而SlCDPK1解口 SlCDPK1原因对核盘菌抗性没 有显著调控作用，但分别正调控对 Pst DC300g Xanthomonasoryzae pv. oryzae (Xoo)的抗性。这些结果说明，SlCDPK和SlCRK广泛参与对各种病害抗性的调控，且不同抗 性有不同的基因参与。另外，酵母双杂交分析结果表明，SlCDPK12与S1CaMl£白 互作。(4)采用本氏烟cDNAC库V

7、IGSW选方法，筛选鉴定了一批草酸耐性和核盘菌 抗性调控基因。从构建的文库中挑取了 511个基因进行VIGS分析，一共筛选获取 了 71个草酸耐性调控基因和63个核盘菌抗性调控基因，其中,Upstream activation factor subunit UAF30( 编号 437)和 Translationally-controlled tumor protein ( 编号502)等基因的沉默植株对草酸耐受力减弱，对核盘菌的抗 性也减弱，而Aspartic proteinase oryzasin-1( 编号135)等基因的沉默植株对 草酸的耐受力增强，对核盘菌抗性也增强。说明这些基因对草酸

8、介导的植物与核盘菌互作起重要调控作用。有些基因只涉及对草酸耐性或核盘菌抗性的调控，说明植物对核盘菌的抗性除了草酸外还有 别的途径。(5)建立了水稻与核盘菌的非寄主抗性互作体系，初步明确了该非寄主互作 的调控机制。核盘菌野生型1980菌株接种24h后水稻叶片产生肉眼可见的类似 HR反应的褐色坏死小斑点。褐色斑点内有大量活性氧积累，核盘菌被限制在坏死区域无法扩展。而不致病的PB菌株接种后水稻叶片没有产生类似反应利用TMTB记方法对接种核盘菌的水稻叶片蛋白表达进行定量分析。对接种野生型1980菌株与不致病的PB菌株之间、以及PB菌株接种与不接种之间的水稻叶片差异表达蛋白分析结果表明，以下蛋白可能参与对核盘菌抗性的调控：P-protein; Proline-rich-like protein; ribonuclease T2family protein;Eukaryotic translation initiation factor3; RALFL4(Rapid ALkalinizationFactor RALFfamily protein); lrgB-like family protein 和 CHIT14(Chitinasefamily protein)以及一组氧化还