分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究

1、前言第 1 页 （共 26 页）分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究1 前言前言1.1 甘蓝型油菜的研究概况甘蓝型油菜的研究概况1.1.1 油菜的生物学基础及其类型油菜的生物学基础及其类型油菜（Rapeseed）是人类栽培的最古老的农作物之一，为十字花科（Cruciferae）芸苔属（Brassica）植物的若干物种所组成，以采籽榨油为种植目的的一年生或越年生草本植物，因其籽实可以榨油，故有油菜之名。它们具有以下共同特点：多为草本，叶互生，花两性，辐射对称，常成总状花序，花瓣黄色，有蜜腺，果常为长角果，种子近球形，无胚乳，含油量高1。同时还具有适应性强、用途广、

2、经济价值高、发展潜力大等优点，菜籽油是良好的食用油，饼粕可作肥料、精饲料和食用蛋白质来源。油菜有两个起源中心。白菜型油菜（Brassica campestris L.）和芥菜型油菜（Bjuncea L.）的起源中心主要在中国和印度；甘蓝型油菜（B. napus L.）的起源中心在欧洲。现在的油菜分类是 1956 年在农业部于四川召开的油菜试验研究座谈会上，刘后利教授根据我国栽培油菜植物学形态特征、遗传亲缘关系、结合农艺性状、栽培利用特点等，将油菜分为三个类型：白菜型油菜、芥菜型油菜、甘蓝型油菜。其基本特点为：白菜型生育期 150200 天，千粒重 3 克左右，产量低，含油量3540 %，抗病性

3、差；芥菜型生育期 160210 天，千粒重 12 克，产量不高，种籽含油量 3035 %，抗旱、抗寒、耐瘠；甘蓝型生育期 170230 天，千粒重 34克，产量较高，含油量 3545 %，抗病、抗寒、适应性强，增产潜力大。根据油菜的生物学特性春化阶段对温度的要求，又可将油菜分为冬油菜和春油菜两种类型。冬油菜型因苗期对低温的要求不同又分为冬性、半冬性和春性。冬性油菜苗期需 05 的低温，经 2040 天才能通过春化阶段进行花芽分化。半冬性油菜苗期对低温的要求不太严格，介于冬春性之间，一般需 515 的温度经过2030 天即可进行花芽分化。春性油菜苗期需 1020 的温度，经过 1520 天即可进

4、行花芽分化。春型油菜苗期对温度的要求与春性油菜类似，适于北方和高寒地区。我国种植的油菜 90%属冬油菜。分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究第 2 页 （共 26 页）油菜按播种季节又可分为秋种油菜和春种油菜2。1.1.2 我国油菜生产概况我国油菜生产概况我国是油菜的主要起源国之一，油菜在我国各省区均有分布，主要分布在长江流域及黄淮流域。油菜的主产省有：安徽、四川、湖北、湖南、江苏、贵州、河南、青海等。50年来，中国油菜生产发展经历了三个阶段：（1）19491979 年：油菜栽培面积不超过250万公顷，单产只400700 公斤公顷，而且长期徘徊不前。（2）19801989 年：油菜栽培面积和单产

5、迅速发展，全国栽培面积为350500 万公顷，单产在11001200 公斤公顷之间。（3）1990现在：中国油菜生产呈现了三个明显的特点：一是栽培面积、单产发展到一个新的水平，达到530690 万公顷，单产12001400 公斤公顷；二是杂交种栽培面积迅速扩大；三是双低品种进入大面积生产3。我国的油菜的品种类型过去以白菜型为主，芥菜型次之，40 年代从英国和日本引入欧洲甘蓝型油菜。中华人民共和国成立初期，我国南方油菜主产区大面积栽培的地方品种都是低产的白菜型油菜。经过大量的调查分析，发现白菜型油菜含油量一般在 35 38 ，但也有高达 45 以上，甚至 50 左右的品种，白菜型油菜，生育期短，

6、能迟播早熟，适于稻、稻、油三熟制地区种植，但其抗病力差，产量较低，增产潜力不大，且产量不稳定。芥菜型油菜含油量一般在 30 %35 %，但也有高达 40 % 以上的品种。有辛辣味，油分品质较差，不耐贮藏。生育期较长，产量低，但抗旱耐瘠性均强。甘蓝型油菜含油量较高，一般在 42 %左右，高的达 50 %以上。成熟迟，生育期长，抗寒和抗病毒能力较强，比较耐肥，产量较高且较稳定，增产潜力大。刘后利在 1960 年中国农业科学院油料所成立大会上提出了油菜育种应以甘蓝型为重点，用高产的甘蓝型逐步取代低产的白菜型的观点。这一观点受到了全国有关人士的赞同。从此，长江流域各省很快育成了一大批甘蓝型油菜的早、中

7、熟品种，对提高我国油菜主产区的产量起到了很大的促进作用。现在我国南方主产省甘蓝型油菜达 7080 。1.1.3 国内外油菜育种研究的状况国内外油菜育种研究的状况油菜是世界范围内广泛种植的油料作物之一，在中国、加拿大、印度及欧盟等都有着广泛的种植，在国际农产品贸易中占有重要地位。因此，油菜育种特别是优质油菜育种引起了各国政府和科研工作者的高度重视。分子生物技术的飞速发展，前言第 3 页 （共 26 页）给油菜分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究第 4 页 （共 26 页）育种赋予了新的活力。油菜生物技术研究起步较晚，始于70年代。但由于油菜是重要的经济作物，再生能力强，且是基因工程载体农杆菌和花椰

8、菜花叶病毒的天然寄主，因此发展较快，已成为生物技术研究的模式植物4。小孢子培养技术：目前，小孢子培养技术已作为成熟技术广泛应用于油菜遗传分析、育种、资源创新等方面，如：利用小孢子培养创建DH（双单倍体）群体，用于性状的遗传分析及其基因定位。在育种程序中利用小孢子培养加速基因型的纯合，提高育种的选择效率，缩短育种年限。将小孢子培养与诱变技术相结合，筛选新的突变体材料。以胚状体为受体进行基因转化，以小孢子胚状体研究基因的表达等等。应用小孢子培养技术，吴江生等选育出华双3号，李加纳等获得了一批甘蓝型黄籽油菜纯系；国外也育成一些品种，如丹麦育成Cyclone和加拿大育成Quantum等，在生产上得到了

9、广泛的应用，表明小孢子培养的育种方法受到各国育种家的广泛关注5。基因工程技术：转基因油菜是转基因研究最为活跃的作物之一，抗除草剂、抗虫、抗病、品质、不育性等转基因油菜品种或材料已获成功6，国外转基因油菜目前已进入大规模商业化应用阶段。Stoutjesdijk等7利用根癌农杆菌介导转化油酸减饱和共抑制结构基因，获得的转基因甘蓝型油菜种子的油酸含量高达89 %，芥菜型油菜的油酸含量高达73 %。在抗真菌方面，主要是利用从一种豆类作物（Phaseolus vulgaris）或西红柿中克隆出的几丁质酶（chitinase）基因和从大麦中克隆的草酸氧化酶（oxalate oxidase）基因。几丁质酶转

10、基因油菜已进入大田试验，草酸氧化酶转基因油菜正在进行实验室试验。在抗病毒病方面，德国克隆并修饰了甜菜花叶病毒外壳蛋白基因，并把它转化到甘蓝型油菜中；澳大利亚将烟草花叶病毒基因导入油菜，得到转基因油菜；中国科学院遗传所和微生物所将芜菁花叶病毒外壳基因转化到甘蓝型油菜中，得到抗病毒的转基因植株3。DNA分子标记技术：DNA分子标记是指能够反映生物个体间差异的具有区别于其它品种的独特标记，即一系列特异DNA片段的组合，具有类似于人的指纹的高度个体特异性和稳定可靠性。DNA分子标记在油菜育种中的应用范围十分广泛。首先，建立了油菜种质资源DNA指纹库，从DNA分子水平上反映基因的多变性，为快速、准确选配

11、育种亲本提供理论依据。其次，DNA分子标记分析应用于品种（杂种）的鉴定，对于保护新品种及育种家的权益具有重要意义，为新品种登记和申请专利提前言第 5 页 （共 26 页）供了分子水平的直接证据。Mailer等8用100个引物对23个澳大利亚甘蓝型油菜栽培品种进行RAPD分析，其中70个引物所扩增的产物产生了DNA电泳带，20个表现出多态性，6个引物就足以区分23个油菜品种。再次，分子标记辅助选择（Molecular Marker-assisted，MAS）是现代分子生物学与传统遗传育种的结合点，通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择，从而达到对作物产量、品质及抗性等综

12、合性状的改良。Plieske等9利用RFLP和AFLP对甘蓝型油菜黑胫病抗性性状进行分子标记辅助选择。目前国际上油菜研究的发展趋势主要是：（1）在普及双低（低芥酸、低硫苷）品种的基础上品质改良将进一步深入、提高，如要求提高油酸含量（由 55 %提高到70 %以上），降低饱和脂肪酸含量（由 7 %降至 4 %以下），降低亚麻酸含量（由10 %降至 3 %4 %），提高含油量（要求大于 42 %44 %）；（2）油菜杂种优势利用将逐步普及，“双低+杂优”育种将是国内外油菜遗传改良的主攻方向；（3）加强油菜抗逆性的遗传改良研究，减少灾害损失，保护环境；（4）生物技术将在油菜遗传改良中得到广泛应用，转

13、基因抗病虫、抗除草剂品种将迅速推广应用；（5）产品加工技术，特别是精深加工技术将进一步发展。1.2 STS 和和 RAPD 分子标记的原理及其在油菜育种中的应用分子标记的原理及其在油菜育种中的应用自1980年以来，随着第一代分子标记RFLP的提出及PCR技术的问世，分子标记技术以不同形式和不同的应用价值迅速发展。DNA分子标记已达几十种，广泛应用于植物分子遗传图谱的构建、植物遗传多样性分析与种质鉴定、重要农艺性状基因定位与图位克隆、转基因植物鉴定和分子标记辅助育种等方面。广义的分子标记（molecular marker）是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工

14、酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记概念只是指DNA标记。DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它能够直接反映基因组DNA间的差异10。常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。其中RFLP属于以Southern杂交为基础的分子标记，RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分子标记，SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分子标记，EST属于以mRNA为基础的分子标记。1.2.1 STS 和和 RAPD 分子标记的基本原理分子标记的基本原理

15、分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究第 6 页 （共 26 页）STS（Sequence Tagged Site），即序列标签位点，是由一段长度为100500 bp的序列所界定的位点，该序列在基因组中通常只出现一次。任何单拷贝的多态性标记都可以作为基因组的界标转变为STS，转变的前提是测定长度适合的单拷贝片段的两端序列，设计一对专一扩增的引物（长度为20个bp左右），用PCR方法显示STS的特异片段11。STS标记的优点在于其共显性遗传方式，因而很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，在基因组作图上具有非常重要的作用，在人类的基因组作图中已被用作物理图谱的构建。STS的开发依赖于测序，但一旦

16、开拓，同行受益。RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA），即随机扩增片段长度多态性DNA，是J.Williams 和J.Welsh 两个研究小组在1990年同时提出的一种新型的遗传标记，该标记技术的操作过程是通常为10碱基寡聚核甘酸的一系列随机引物，在低温退火条件下对基因组DNA进行PCR扩增，通过凝胶电泳和染色来检测扩增产物片段的多态性。RAPD标记具有引物通用、分析程序快速简便、所需DNA量极少、不需放射性同位素等特点。但RAPD是一类显性的遗传标记，加上其稳定性、重复性和可靠性较差，限制了其应用12，为了提高RAPD标记的稳定性，可以将其转化为SCAR

17、标记。1.2.2 STS 和和 RAPD 分子标记在油菜研究中的应用分子标记在油菜研究中的应用分子标记技术在油菜育种13中的应用已展示出广阔的前景，概括起来大致有以下几方面：（1）广泛开发利用种质资源，拓宽育种基础。利用分子标记技术，能够准确鉴定种质资源中的优异农艺性状基因的多样性，特别是能够从农艺性状不良的野生种中，鉴定出其中蕴藏着的优良农艺性状基因，这将发掘出大量的未被利用的优良农艺性状的基因，大大拓宽育种的物质基础。（2）标记重要基因，提高育种效率。有些重要基因，如抗病基因检测不仅很费时，还受植物发育阶段的限制。利用与这些基因紧密连锁的分子标记，无疑有助于在育种过程中对特定基因型的选择；

18、这将大大缩短育种周期，提高育种效率。王俊霞等用BAS从860个随机引物中筛选出与Pol CMS 恢复基因（RF）连锁的2个RAPD标记AH 19.690和AI16.830，现以把这2个RAPD标记用于选育Pol CMS新恢复系的研究14。（3）鉴定遗传多样性，确定杂优育种的亲本选配。杂优育种是粮食产量取得突破的另一条重要途径。分子标记可以揭示杂种优势的遗传基础，鉴定种质资源亲本的遗传多样性，对其进行分类，从前言第 7 页 （共 26 页）而有效地选配亲本。（4）揭示物种亲缘关系，有效进行种质资源创新。野生近缘植物是一个巨大的基因宝库。通过远缘杂交进行种质创新，是育种工作取得突破的途径之一，在远

19、缘杂交中，分子标记不仅可以精确检测外源染色体，而且可以广泛地揭示外源染色体与栽培物种染色体的部分同源关系，这对有效转移外源基因十分重要。1.3 立题背景和研究内容立题背景和研究内容1.3.1 立题背景立题背景我国的主要栽培种属于甘蓝型油菜，但甘蓝型油菜经常遭受病毒病、菌核病、软腐病、霜霉病等病害的危害，且危害极大，给农业生产造成了巨大的经济损失。因此培养高抗的甘蓝型油菜新品种是当今的重要育种目标之一。各国已相继开展了一些油菜转基因抗病育种工作15。但育成的优良抗病品种会随着时间的推移，病原菌由于适应性等的改变或发生突变等变异，从而使抗病品种逐渐表现出抗病性减弱，甚至最终完全丧失抗病性，失去利用

20、价值16。因此，在抗病育种上，就需要反复地进行新抗源的筛选，不断地探索新的育种技术和寻找新的抗源。但由于传统的抗病鉴定存在周期长，操作烦琐等确定，所以筛选新的抗病材料比较困难，需要的周期也比较长。近年来随着植物分子遗传学和DNA分子标记技术的发展，分子标记技术以其高效、准确、快速的特点被大量的应用于辅助育种，并取得了良好的效果。另外，前人已分别从拟南芥、甜菜、水稻、玉米、小麦、大麦、番茄和马铃薯等植物中克隆出了近 40 种抗病基因17，它们分别介导对植物病原菌、细菌、病毒和线虫的抗性18。由于植物中的抗病基因多存在同源性19，其表达产物在不同的物种具有典型的保守结构区域，按其序列的同源性可以将

21、其归为 NBS-LRR，LZ，LRR-STK 等几个超家族。根据这些保守序列设计合适的引物进行 PCR 扩增，即得到抗病基因类似序列（RGA） 。通过对 RGA 与 R 基因关系的分析表明，RGA 不仅在抗病基因定位和抗病基因系统进化研究中有重要作用，而且有可能为克隆 R 基因提供一条崭新而又便捷的途径。大量研究表明，RGA 与 R 基因之间的关系主要有 3 种：第一，RGA 是 R 基因的一部分；第二，RGA 与 R 基因紧密连锁；第三，RGA 与目的抗病基因无关。RGA 在一定程度上反映了 R 基因，由于 RGA 相对容易获得，所以研究 RGA 在基因组中的分布和演化在一定程度上可以说明

22、R 基因的情况。该方法为作物抗病虫育种寻找新抗源（特别对于遗传背景不甚清楚或抗病基因未知的作物）分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究第 8 页 （共 26 页）提供了最好、最快捷的途径20。因此，利用分子标记技术对现有甘蓝型油菜品种进行抗病筛选，将会快速而准确的获得抗病材料，为油菜抗病品种选育和品种的遗传改良带来便利。材料与方法第 9 页 （共 26 页）1.3.2 主要研究内容主要研究内容前期根据已克隆的植物抗病基因Xal、Pto、Rar 等的保守区域设计31 对特异引物，用它们对22 种已知来源的甘蓝型油菜品种进行PCR扩增，通过扩增产物的“有”、 “无”来判断材料的抗病性。由于任何已知其在

23、基因组中位置的DNA 序列，都能用作STS 标记21，因此把扩增得到的产物即RGA 作为STS 标记，把得到的这些STS 标记和已知材料的抗病性联系起来，从而找到一些抗病基因的特异分子标记。这些STS分子标记将为甘蓝型油菜的抗病育种提供了良好的分子生物学基础。同时，本实验用15 对随机引物对这些品种进行RAPD 扩增，采用UPGMA 非加权组法对扩增出的谱带进行遗传聚类分析，得出反映各品种间亲缘关系的树状图，为抗病育种的材料来源提供选择依据。2 材料与方法材料与方法2.1 材料材料2.1.1 实验材料及来源实验材料及来源实验材料见表 1，2006 年 10 月进行田间播种，2007 年 3 月

24、 8 日取各油菜品种的幼嫩叶片，置于70冰箱保存备用。2.1.2 药品及其配方药品及其配方1.CTAB（cetyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化胺）Buffer：2 %（w/v）CTAB，2 % PVP（polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮） ，100 mmolL-1 Tris-HCl，20 mmolL-1 EDTA，1.4 molL-1 NaCl，pH8.0，灭菌后室温保存。用前加入巯基乙醇至终浓度为 2 %。2.氯仿：异戊醇： 24：1（v/v） ，4 避光短期保存。3.异丙醇。4.75 %乙醇。5.无水乙醇。6.RNaseA。7

25、.酚：氯仿：异戊醇： 25：24：1（v/v） ，4 避光短期保存。8.乙酸钠：3 molL-1水溶液，pH 5.2，灭菌后 4 保存。分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究第 10 页 （共 26 页）9.TE 溶液：10 mmolL-1 Tris-HCl，1.00 mmolL-1 EDTA，pH 视需要而定，灭菌后 4 保存。10. PCR 反应药品：PCR Buffer，Taq DNA Polymerase，Mg2+，dNTPs。11. 琼脂糖。12. 500 的 Tris-乙酸（TAE）电泳缓冲液贮存液：242 gL-1 Tris 碱，57.1 mLL-1冰乙酸，50 mmolL-1 ED

26、TA，水溶液，pH 8.0，使用时稀释 50 倍。13. 凝胶加样缓冲液：0.25 % 溴酚兰，40 %（w/v）蔗糖，水溶液，灭菌后 4 保存。14. EB：溴化乙锭，10 mgmL-1。15. DNA Hind/EcoR和 DL2000 Marker。16. ddH2O：灭菌后待用。表表 1 筛选抗病材料的甘蓝型油菜品种筛选抗病材料的甘蓝型油菜品种实验编号田间编号品种（品系、材料）名称种名种皮色泽备注1R06001华双 5 号B. napus黑种子公司2R06002丰油 701B. napus黑种子公司3R06004秦油 7 号B. napus黑种子公司4R06005泸油 15B. nap

27、us黑种子公司5R06006中油 821B. napus黑种子公司6R06007中双 10 号B. napus黑种子公司7R06008浙双 3 号B. napus黑种子公司8R06009超丰油二号B. napus黑种子公司9R06011绵油 8 号B. napus黑种子公司10R06013蓉油 8 号B. napus黑种子公司11R06014南油 6 号B. napus黑种子公司12R0601597381B. napus黑种子公司13R06016中油杂 9 号B. napus黑种子公司14R06017乐油 3 号B. napus黑种子公司15R06019惠油一号B. napus黑种子公司16R

28、06020华杂 7 号B. napus黑种子公司17R06021中双 6 号B. napus黑种子公司18R06023蓉油 6 号B. napus黑种子公司19R06024黔油一号B. napus黑种子公司20R06025D2B. napus黑西南大学21R06063R06063B. napus黑西南大学22R06066中双 9 号B. napus褐种子公司材料与方法第 11 页 （共 26 页）2.1.3 本实验所用的特异引物和随机引物本实验所用的特异引物和随机引物表表 2 特异引物特异引物编号序列退火温度（）1FL6T： 5-ATTTCCCTCCGTGGAGTATGA-3RL6T： 5-G

29、TGCCATCCTTTTAAGTCTCC-349.82FXa1：5-ATTGTAGGCAATGGAGGGATA-3RXa1：5-CACAAATCCTTGAGCAATCCA-350.53FLr10：5-GCAAGAATAGTTGTGGCAGTGTA-3RLr10：5-GTGCCTTACCATCATATGGCA-351.54FPto：5-CATCCGCATCTGGTTTCATTG-3RPto：5-TGGAAGAGATTGAACTATGGCA-351.65FmLo1：5-TCATGCTGGTGGGCTTCATCT-3RmLo1：5-TGATCCCATCTGTGTGACGAG-353.06FXa21：

30、5-CCAATTTGTTGGGTTCTGGATC-3RXa21：5-ATCCCATCGAGCTTGTTGACT-352.77FPib：5-GGAATGGGTGGCCTTGGAAAA-3RPib：5-CTGGTCTTCAGGGAAAATGGA-353.18FHs1：5-GTTTGGGCCTTGGTGAGCCCAATT-3RHs1：5-AAGTCTTGGCACCATCCAAAC-353.19S1：5-GGTGGGGTTGGGAAGACAACG-3AS3：5-NAGNGCNAGNGGNAGNCC-352.910RN2Fw：5-GGNGGNWSNGGNAARACNAC-3RN2Rv：5-GCNGCNA

31、RNGGRTTNCC-352.511FCF-5：5-CTGGAAGTGTTGTATATGTCGAGAAACA-3RCF-5：5-TGTCTCCTAAATCAAGAACTTGCAG-353.812FPS5：5- ATGGGGGGAGTAGGCAAAA-3RPS5：5- GTCATCCAACAATAAAACAAA-344.613FPrf：5-GGCAAGACTACACTAGCAAA-3RPrf：5-TACAAACCCTTCAGCTACCCA-344.814FCf-4：5-TGGGAGTATACCTTCCTGGA-3RCf-4：5-ACCTAGATCAAGTAGTGTCA-337.715FHcr9：

32、 5-AGCCATCTAACTTCACTTCA-3RHcr9： 5-TCTTCTGGTTTAGGAGTGA-341.416FAsc：5-CTTTCTGTGACTTGTAATGAG-3RAsc：5-CCAAAAGAGGTGAAGAACCAG-341.417RK2Fw：5-TTYGGNTCNGTNTAYMRNGG-3RK2Rv：5-AYNCCRWARCTRTANAYRTC-341.818FRar：5-GCATACAACTGAGAAACCAGT-3RRar：5-ATCACAACACTTCCACCCTCT-346.019FL11：5-GGTATGGGTGGAATAGGCAAG-3RL11：5-GAAG

33、CAAGCTATATCCAAGAA-346.2分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究第 12 页 （共 26 页）表表 2 特异引物（续）特异引物（续）20FPM：5-TTGCTGATCTGGGTTTGTGTC-3RPM：5-GTAGCTGAGCTTGAGTATTGG-346.321FRx：5-GAATGAAGAAGAGGGAAAAAGCA-3RRx：5-AGTTTGCAGATAGCATAGGC-346.622FRAC1N：5-GATTGGTAAGACTACCATTGC-3RRAC1N：5-GCAAGGACTTGATGGTTGTGA-345.823Pto2kin1： 5-GCATTGGAACAAG

34、GTGAA-3Pto2kin2： 5-AGGGGGACCACCACGTAG-345.924RN1Fw：5-GGNGGNNTNGGNAARACNAC-3RN1Rv：5-ANNSHNARNGGNARNCC-345.525FI2（I2）：5-ACTGCCCTTAGCTCTGAAGA-3RI2（I2）：5-TCAAGATGACGCAAGTTAATC-347.226FMLa：5-GAATAATCTAGGCAGTCGGCT-3RMLa：5-GAGCAAATACAGGCTATTTCC-347.927FNN： 5-TGATGGTGCTTGTTTCCTTA-3RNN： 5-TGGGCTCTAATCCATCATA

35、AC-348.228FM：5-CTTTATGGTATGGGCGGAATA-3RM：5-CTTCAAAGTCAATGGAAGTCC-348.029FMi-1：5-AGGTAAAACTACTTTGGCATACA-3RMi-1：5-CACCAAAGGAAGCCCTTTACA-347.730FRPM1：5-GTTGTGCTTGATGATGTATGG-3RRPM1：5-TCACTCCTCTGATCGGTTCCA -347.831RK1Fw：5-TTYGGNRDNGTNTAYMRNGG-3RK1Rv：5-AYNCCRWANGARTANAYRTC-342.9表表 3 随机引物随机引物实验编号原编号序列退火温

36、度（）S1A-165-AGCCAGCGAA-339S2A-175-GACCGCTTGT-339S3D-065-ACCTGAACGG-339S4D-075-TTGGCACGGG-339S5C-025-GTGAGGCGTC-339S6C-055-GATGACCGCC-339S7C-085-TGGACCGGTG-339S8C-095-CTCACCGTCC-339S9C-105-TGTCTGGGTG-339S10C-115-TGTCTGGGTG-339S11C-135-AAGCCTCGTC-339S12C-155-GACGGATCAG-339S13C-165-CACACTCCAG-339S14C-17

37、5-TTCCCCCCAG-339S15G-055-CTGAGACGGA-339以上引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。材料与方法第 13 页 （共 26 页）2.2 实验方法实验方法2.2.1 CTAB 法法22提取油菜基因组提取油菜基因组 DNA称取 5.00 g 幼叶用液氮磨成粉末，迅速转入预热的 20 mL CTAB Buffer 中，迅速混匀。1.65 水浴 45 min，中途间隔（轻柔）振荡三次混匀。2.冷却后加入 20 mL 氯仿：异戊醇（24：1） ，轻柔上下颠倒混匀使乳化 10 min。3.8000g，18，离心 10 min，取上清，重复一次。4.取上清，加入等体积室温异丙

38、醇，颠倒混匀。5.用枪口被剪大的 1.5 mL Tip 头吸出 DNA 沉淀，转入盛有 1 mL 75%乙醇的1.5 mL 离心管中。6.在 75%乙醇中漂洗 DNA 数次，无水乙醇漂洗一次。7.沉淀于室温干燥后用 500 L TE 溶解沉淀，同时加入 60 g 无 DNase 的RNaseA。8.37 水解 RNA 30 min 以上。9.10000g 常温离心 10 min。10. 吸取上清，加入 500 L 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） ，轻轻颠倒混匀 10 min。11. 10000g 常温离心 10 min。12. 吸取上清，加入 500 L 氯仿：异戊醇（24：1） ，轻轻颠

39、倒 10 min。13. 10000g 常温离心 10 min。14. 吸取上清，加入 1/10 体积的 pH 5.2 的 3 molL-1 NaAc，并加入 2.5 倍体积无水乙醇。15. 8000g 常温离心 2 min。16. 弃上清，沉淀用 500 L 75 乙醇漂洗 3 次。17. 室温干燥沉淀，溶入 100200 L 重蒸水。18. 进行电泳及分光光度计检测，DNA 浓度 C（gL-1）=50OD260稀释倍数10-3，OD260/OD280一般要求在 1.6 以上可用。总 DNA 检测及稀释：取 10 L DNA 样品，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测。另取分子标记筛选甘蓝型油菜抗病

40、材料研究第 14 页 （共 26 页）10 L DNA 样品稀释 300 倍，用 Gene QuantRNA/DNA Calculator 测定总 DNA 样品的浓度。然后从总 DNA 样品中取 10 L，根据测定的浓度值将它稀释成 10 倍的工作液，置 4 保存，总 DNA 样品置20 冰箱保存。2.2.2 PCR 反应体系的建立反应体系的建立1. STS 反应体系在 PCR 薄壁管中建立 20 L（体积）的反应体系，见表 4：表表 4 4 STS 反应体系反应体系试剂用量10buffer2.0 LMg2+（2.5 mmolL-1）1.6 LdNTP（各 2.5 mmolL-1）1.6 L引

41、物 F（10 molL-1）0.5 L引物 R（10 molL-1）0.5 LTaq 酶（2 UL-1）0.5 L模板 DNA1.5 LddH2O11.8 L反应前每管加一滴矿物油。扩增反应在 Hybaid PCR 仪上进行。扩增程序为23：94 变性 5 min，94 变性 1 min，特定的退火温度退火 1 min，72 延伸 1 min，30个循环后于 72 延伸 10 min，4 保存。2. RAPD 反应体系在 PCR 薄壁管中建立 20 L（体积）的反应体系，见表 5：反应前每管加一滴矿物油。扩增反应在 Hybaid PCR 仪上进行。扩增程序为：94 变性 5 min，94 变性

42、 1 min，39 退火 1 min，72 延伸 1 min，30 个循环后于 72 延伸 10 min，4 保存。材料与方法第 15 页 （共 26 页）表表 5 5 RAPD 反应体系反应体系试剂用量10buffer（with Mg2+）2.0LdNTP（各 2.5 mmolL-1）1.6L引物（10 molL-1）1.0LTaq 酶（2.5UL-1）0.5L模板 DNA1.5LddH2O13.4L2.2.3 电泳检测及带型统计电泳检测及带型统计1.1的琼脂糖凝胶制备：量取 50 mL TAE 缓冲液，稀释至 150 mL，再称取1.5 g 琼脂糖粉，与缓冲液一起到入 500 mL 锥型瓶

43、中混合，置于微波炉加热5 min，待冷却到 50 时，加入一滴 EB，混匀，并在制胶板中到胶。2.每管扩增产物中加 5 L 上样缓冲液，取 15 L 扩增产物加在 1.0 %琼脂糖凝胶（已加有 EB）点样孔上，并且每块凝胶上点 5 L DNA Marker。电泳（5 V/cm）1.52.5 小时左右，然后在英国产的 Syngene 凝胶成像分析系统中观察并照相。3.STS 带型统计：对每一对引物扩增的结果进行统计，有带记为“1”，说明该品种有目标抗病基因的类似序列或存在目标抗病基因。无带记为“0”，说明该品种没有目标抗病基因或因引物退火温度不适而无扩增，有待继续摸索条件。RAPD带型统计24：

44、对22种油菜RAPD带型总数、多态性带型数目进行统计。统计时，取清晰、易辨的带型进行计数，否则不予统计。每个样品的扩增带按有“1”，无“0”记录。分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究第 16 页 （共 26 页）2.2.4 数据处理和聚类分析数据处理和聚类分析将带型统计数据按Excel格式输入计算机，利用NTSYS-PC（2.0）软件计算品种间的遗传相似系数，对得到的遗传相似性矩阵进行非加权组法（UPGMA）聚类分析，建立油菜品种的聚类分析树状图。3 结果与分析结果与分析3.1 基因组基因组 DNA 的提取与纯化的提取与纯化22 种甘蓝型油菜基因组 DNA 电泳检测结果见图 1。从电泳图谱可看出

45、，用CTAB 法提取的基因组 DNA 样品几乎没有降解，浓度也较高。Gene QuantRNA/DNA Calculator 检测浓度大多在 5003000 gmL-1。OD260/OD280大多在 1.72.0 之间，这些基因组 DNA 完全可用于下一步的 PCR 扩增。图图 1 22 种油菜基因种油菜基因组组 DNA 电电泳泳图谱图谱3.2 电泳检测及带型统计电泳检测及带型统计3.2.1 STS 特异引物扩增结果分析特异引物扩增结果分析31 对 STS 特异引物分别对 22 个样品进行筛选结果统计见表 6。结果几乎在所有的品种中都检测到有 R 基因类似序列或 R 基因的存在，并且每个品种至

46、少存在 1 个R 基因类似序列或 R 基因，有些品种还存在多个不同的 R 基因或 R 基因类似序列。从统计结果看，RPS5、Prf、RPM1 等 3 个 R 基因存在于所有的材料中，它们分别介导对霜霉病、青枯病和细菌性斑点病的抗性。Rar、L11、PM、Rx、I2、MLa、NN、M 等 R 基因也广泛地存在于不同材料中，它们分别介导对黄萎病、锈病和枯萎病的抗性。其中，Xal 基因只在 22 号材料中存在，它介导对白叶枯病的抗性。Hs1 基因只存在于 2 号材料中，它介导对孢囊线虫病的抗性。MLo1 基因存在于 11、14、15、16、和 18 号等少数材料中，它介导对白粉病的抗性。Xa21 基

47、因存在于 2、3、8、9、10、11 和 16 号等少数材料中，它介导对白材料与方法第 17 页 （共 26 页）叶枯病的抗性。其中，引物 12 扩增特异效果明显。分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究第 18 页 （共 26 页）图图 2 特异引物特异引物 2 扩扩增增结结果果（1-22 为品种编号，M 为 DL2000 标准分子量）图图 3 特异引物特异引物 12 扩扩增增结结果果（1-22 为品种编号，M 为 DL2000 标准分子量）图图 4 特异引物特异引物 30 扩扩增增结结果果（1-22 为品种编号，23 为 DL2000 标准分子量）结果与分析第 19 页 （共 26 页）表表 6

48、 31 对对 STS 特异引物分别对特异引物分别对 22 种样品进行筛选结果统计种样品进行筛选结果统计品种引物12345678910111213141516171819202122100000000000000000000002000000000000000000000130000000000000000000000400000000000000000000005000000000010011101000060110000111100001000000711101110010110000110008010000000000000000000090000000000000000000000100

49、000000000000000000000110000000000000000000000121111111111111111111111131111111111111111111111140000000000000000000000150000000000000000000000160000000000000000000000170000000000000000000000180111111011111111111111190000111111111111111111200000000001111111111111210000000000000111111011220000000000000

50、000000000230000000000000000000000240000000000000000000000250000000000011011111111260000000001011111111101270000000000010111111110280000000001010000001110290000000000000000000000301111111111111111111111310000000000000000000000分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究第 20 页 （共 26 页）3.2.2 RAPD 随机引物扩增结果统计随机引物扩增结果统计用 15 条随机引物对

51、22 个样品进行扩增，其中，有 13 条引物能有效扩增出条带，2 条没有扩增产物，不予统计。共扩增出 60 条带，多态性带 52 条，多态性带百分率为 86.7 。扩增出的 RAPD 带型大部分在 500 bp-2000 bp 之间。文中只选出 2 个多态性最好的引物扩增出的代表性图。图图5 随机引物随机引物S1扩扩增增22个油菜品种的个油菜品种的RAPD带带型型（1-22为品种编号，M为 DNA Hind/EcoR标准分子量）图图6 随机引物随机引物S4扩扩增增22个油菜品种的个油菜品种的RAPD带带型型（1-22为品种编号，M为 DNA Hind/EcoR标准分子量）结果与分析第 21 页

52、 （共 26 页）图图7 22个甘个甘蓝蓝型油菜品种聚型油菜品种聚类类分析分析树树状状图图3.3 聚类分析聚类分析用NTSYS-PC（2.0）软件对22个油菜品种进行遗传相似性分析，用UPGMA非加权组法聚类，所得反映各种间亲缘关系的树状聚类图见图7。在相似系数0.64 处，可将22 种材料分为两大类，1 和4 号为第一大类，其余为第二大类。其中，第二大类又可以分为三小类，2，3，7，8，9，10号聚为一类，6，16，15，21，14，17，18，19，22，20，11，12，13号聚为一类，5 号单独聚为一类。从图7可以看出，22个品种聚类较为紧密，它们亲缘关系比较近，特别是第二大类表现更为

53、明显。虽然供试品种都是甘蓝型油菜，但从聚类分析图上看，可将它们较为明显的分为四类，因此，可以认为这四类有着不同的遗传背景。在育种上，可以将这些品种的分类结果与STS标记筛选的抗病品种联系起来，即把具有相同抗病基因但有不同遗传背景的材料作为育种材料，为育种工作带来更为广泛的病源材料。4 讨论讨论4.1 基因组基因组 DNA 的提取与纯化的提取与纯化从实验材料中提取完整的总 DNA 是一项基本的分子生物学技术，其质量的好Coefficient0.640.710.780.850.9210 1 4 2 3 7 8 9 10 6 16 15 21 14 17 18 19 22 20 11 12 13 5

54、 分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究第 22 页 （共 26 页）坏直接关系到实验的成功与否。因此，总 DNA 的提取方法至关重要。目前已经建立了讨论第 23 页 （共 26 页）很多 DNA 提取方法，如 CTAB 法，SDS 法，试剂盒法，高盐低 pH 法等。但植物基因组 DNA 提取常用 CTAB 法12。本实验用 CTAB 法大规模提取基因组 DNA 比较成功，纯度较高，产量也较大。这种方法提取的 DNA 更适用目的基因的克隆。但此法步骤较多，耗时较长，因此有必要改进实验步骤。其中 TE 溶解 DNA 这一步可以在 37 水欲中进行，DNA 的干燥可在超净工作台上吹干。4.2 STS

55、分析分析STS 分子标记筛选出来的抗病标记将为甘蓝型油菜的抗病育种工作提供实践基础。但是，由于某些品种 PCR 扩增的特异性不强，并且，植物中有许多与 LRR 或NBS 序列同源的基因，它们并不都与抗病性相关25，因此，要确定所筛选出的标记是不是目的抗病基因标记，还需要做大量的检测分析工作。还有一些特异引物没有扩增出产物，这可能与引物退火温度不适有关，有待摸索引物退火条件，还有可能就是这些抗病基因不存在于所筛选的材料中，后期需要扩大筛选范围。4.3 RAPD分析分析RAPD是一种显性标记，它能从分子水平上揭示品种间存在的亲缘关系。本文用RAPD标记很好地将22个供试品种进行了亲缘关系分类，将这

56、些品种的分类结果与STS标记筛选的抗病品种联系起来，就可以得到不同来源的抗病育种材料，为育种工作带来更为广泛的抗源材料。由于RAPD技术稳定性较差，而且在读带过程有人为误差，所以给重复实验带来困难26，要想将22个品种准确分类还需进行摸索和深入研究。本实验结果可以为油菜抗病育种提供粗略参考。随着对分子标记的深入研究最终将会达到分离、克隆并在DNA 水平上直接操纵抗病基因的目的。从而分子标记技术将在油菜育种中得到更广泛的应用，为开发与应用油菜的抗病基因，改良现有组合的杂种优势，提高对杂种优势的预测能力，提高选择效率，更快地培育出更好的品种都具有重大意义。参考文献1 徐汉卿主编植物学M 北京：中国

57、农业出版社，2003，1421432 李成等编著油菜增效栽培M 安徽：安徽科学技术出版社，2006，12293 傅延栋中国油菜生产和品种改良的现状与前景J 安徽农学通报，2000，6(1)：28分子标记筛选甘蓝型油菜抗病材料研究第 24 页 （共 26 页）4 刘忠松，官春云油菜育种与生物技术J 作物研究，1994，8(2)：8125 王新发，王汉中，刘贵华现代生物技术在油菜育种中的应用及前景J 中国油料作物学报，2002，24(3)：74776 黄虎兰，程爱武中国转基因油菜研究的现状分析及其发展探讨J 湖南农业科学，2003，(6)：12147 Stoutjesdijk P A, Hurlestone C, Singh S, et al. High-oleic acid Australian Brassica napus and B.jun