QC-FF-0039 微生物限度检查法标准操作规程

1、 -微生物限度检查法标准操作规程文件编号：QC-FF-0039版本号：00第 29 页 共 29 页目的：建立微生物限度检查法标准操作规程范围：本规范适用于微生物限度检查法检查职责：质量控制部全体人员内容：第一部分：综述1.简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。细菌、霉菌和酵母菌计数除另有规定外均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上常用的一种方法。以琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在规定

2、条件下所生长的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数，不包括对营养、氧气、温度、PH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数，不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。在进行本法测定时，必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。2.设备与仪器2.1设备2.1.1无菌室 微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。2.1.1.1结构和要求见中国药典二部无菌检查法2.1.1.2操作间 操作间应安装空气除菌过滤层流装置。环境洁净度不应低于10000

3、级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9Pa。操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。2.1.1.3缓冲间 缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。2.1.1.4洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。沉降菌数测定（ 法）无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30-35预培养48h，证明无菌落生长），以无

4、菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在30-35培养箱内，倒置培养48h,取出检查。 3个平板生长的平均菌落数不超过1个。2.1.1.5在每次操作前、后，用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。2.1.2阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试品检验用的无菌室内或净化工作台上操作。2.1.3无菌室与洗刷、灭菌消毒、培养、结果观察及办公间等配套设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。2.2仪器2.2.1恒温培养箱（30-35）、生化培养箱（20-25）、微波

5、炉、匀浆仪（3000-8000r/min）或康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250-300）、电冰箱、离心机、离心管、0.45m滤膜及薄膜过滤器、蒸汽灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。菌落计数器、显微镜（1500x）、电子天平或天平（感量0.1g）， 系列比色计。2.2.2玻璃器皿锥形瓶（250-300ml,，内装玻璃珠若干；500ml，1000ml）、培养皿(直径9cm）、量筒（100ml，500ml）、试管（18mm×18mm、28mm×198mm ）及塞、吸管(1ml分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20ml或30ml等）

6、、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）、不锈钢桶（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口上端距处塞入约2cm适宜疏松的棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于高压蒸汽121灭菌30min，烘干或160干热灭菌2h，备用。2.2.3用具大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%-75%乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。接种环（白铱金或镍

7、铬合金，环径4-5mm、长度6-10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。3.试液、稀释剂和试剂3.1试液3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液或其它适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。3.1.2 5%石碳酸溶液或其他适宜消毒液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）。3.1.3 75%乙醇溶液。3.1.4 碘酊或碘伏溶液。3.2稀释剂和试剂稀释剂配制后，高压蒸汽灭菌法灭菌。3.2.1 0.9%无菌氯化钠溶液。3.2.2 PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液。3.

8、2.3 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液。3.2.4 PH6.8无菌磷酸盐缓冲液。3.2.5 PH7.6无菌磷酸盐缓冲液按药典附录 配制后，过滤，分装，灭菌。3.2.6 0.1%无菌氯化三苯四氮唑溶液（TTC）。3.2.7 PH7.2无菌磷酸盐缓冲液。4.培养基4.1营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。4.2培养基制备注意事项：采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基PH值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。4.3配制的培养基不应有沉淀。如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。4.4培养基的分装量

9、不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。4.5培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。4.6灭菌后的培养基应保存在2-25，防止被污染，可在三周内用毕；保存于密闭容器中，可在一年内使用。制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分散失及染菌。4.7用水浴或微波炉加热溶化琼脂培养基，勿用电炉直接溶化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏。已溶化的培养基应一次用完，剩余培养基不宜再用。培养基不能反复加热溶化。5.供试品抽样、保存及检验量5.1抽样5.1.1一般采用随机抽样方法，其抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3-5倍量（以备复试或留样观察）。

10、5.1.2抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品。机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。5.1.3凡药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。5.2保存5.2.1供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内的污染菌因保存条件不妥导致死亡，损伤或繁殖。5.2.2供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。5.3检验量5.3.1所有剂型的检验量均需取自2个以上包装单位（中药蜜丸需取自4丸、膜剂取4片以上）。5.3.2固体及半固体（黏稠性供试品）制剂检验量为10g。5.3.

11、4液体制剂检验量为10ml。5.3.4膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为25cm2（中药膜剂较厚，不宜取量过多），化学药及生化药膜剂检验量为50cm2 。5.3.5特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3g ，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。5.3.6要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。5.3.7包装材料，除另有规定外其检验量20 cm2。6.试验准备6.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管、量筒、稀释剂等经传递窗移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先做好计划，准备足够

12、用量，避免操作中出入无菌间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。6.2.开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。6.3关闭紫外杀菌灯后，操作人员用肥皂洗手，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。6.4操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。7.供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。如使用了乳化剂、分散剂、中和剂或灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。供试液的制备

13、若需用水浴加温时，温度不应超过45 ，30min。除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：7.1液体供试品 取供试品10ml，加 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml 。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。7.2固体、半固体或黏稠液供试品 取供试品 ，加0.9%无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。蜜丸等需剪碎，放入匀浆杯。7.3非水溶性供试品软膏、乳膏剂

14、先将已备妥灭菌的含司盘 、单硬脂酸甘油脂 、聚山梨脂80的混合物融化，待冷至45时，加入供试品5g（或5ml），立即用玻棒搅拌均匀，分次少量慢慢加入45的PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。7.3.2油剂 取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯 ，摇匀，再加入0.9%无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml7.3.3栓剂 称取供试品10g ，置灭菌锥形瓶中，加适量PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，置45水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯80，振摇使之乳化，再加PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml ），摇匀。

15、7.3.4眼膏剂 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法选用孔径为0.22m)的脂溶性滤膜，以薄膜过滤法过滤除菌。滤器在140干热灭菌2小时，然后加入45的PH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100，振摇5-10min，萃取，待油水明显分层，取其水层作为供试液。7.4非水溶性膜剂供试品 化学药膜剂一般取样为100cm2，置灭菌锥形瓶中，加入适量的PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，于45水浴中保温，浸泡，振摇，以供试品浸液作为供试液。中药膜剂取，剪碎，加适量的PH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（通常加1ml或2ml ），浸泡，振摇，以供试品浸液作为供试液。7.5肠溶及结肠溶制剂供试

16、品 取供试品10g，肠溶制剂加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，结肠溶制剂加PH7.6无菌磷酸盐缓冲液至100ml，均置45水浴中，振摇，使溶解，作为供试液。7.6气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冰箱冰冻室内约1h 。取出，速消毒供试品容器的开启部位周围，用无菌钢锥在容器上消毒部位钻一小孔，在室温轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的PH7.0氯化钠无菌蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1:10的供试液。7.7茶剂 取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振

17、摇2-3min，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1:10加稀释剂，浸泡30min）以上供试品如吸水膨胀，或黏度过高，可增加稀释剂的量，制成1:20-1:100供试液。7.8具抑菌活性的供试品 当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下：7.8.1稀释法 取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时，1ml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。7.8.2离心沉淀集菌法 取规定量的供试液， ，3000r/min离心20mi

18、n，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。如供试液中有不溶颗粒、沉淀，先以500r/min，离心5min，留离心沉淀物，取全部上清液按上述高速再离心，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。7.8.3薄膜过滤法 见细菌、霉菌和酵母菌计数 。7.8.4中和法 凡含汞、砷或防腐剂等的供试品，可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性，制成供试液。7.9包装材料供试品 取试样用开孔面积为20cm2的消毒过的金属模板压在内层表面上，将无菌棉签用氯化钠注射液稍沾湿，在板孔范围内擦抹5次，换1支棉签再擦抹5次，每个位置用2支棉签共擦抹10次，共擦抹5个位置100 cm2。每支棉签抹完后立即剪断（

19、或烧断），投入盛有30ml无菌生理盐水的锥形瓶（或大试管）中。全部擦抹棉签投入瓶中后，将瓶迅速摇晃1分钟，即得供试液。8.供试液的释稀（10倍递增稀释法）8.1取3-4支灭菌试管，分别加入9mlPH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液。加稀释剂后，试管塞应立即塞上。8.2另取1支1ML灭菌吸管吸1:10均匀供试液1ml ，加入装有9mlPH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液的试管中，（此时操作一般为左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量。切勿在乙醇灯焰峰的正上方操作，以免灯焰将供试液中的菌细胞杀灭）混匀，即1:100； 供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1:103、1:104 等适宜

20、稀释级（3-4）。每递增 稀释级，必须另换一支吸管。在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁，调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面），缓慢地放出全部供试液（吸管内应无粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。9.计数方法验证由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法进行。对各试验菌的回收率应逐一进

21、行验证。9.1验证用菌株 大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基；白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中,培养24-48h，黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基，培养5-7天。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含500-1000个cfu 的菌悬液。9.2验证方法 验证试验分四组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。9.2.1试验组 取最低稀释级的供试液，按每1ml供试液加入50-100cfu试验菌，按菌落计数方法测定其菌数。平皿法计数时，取试验菌液、供试液

22、分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基；薄膜过滤法计数时，取供试液2ml过滤，冲洗液冲洗，并在最后一次的冲洗液中加入试验菌。9.2.2菌液组 取上述试验菌液，测定其加入的试验菌菌数。9.2.3供试品对照组 取最低稀释级的供试液1ml，按菌落计数方法测定其所含菌数。9.2.4释释剂对照组 为考察供试液制备过程对微生物的影响程度，可用相应的稀释液替代供试液，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml含50-100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。9.2.5试验组的菌回收率（%）=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组的平均菌落数×100%9.2.6稀释剂对照组的

23、菌回收率（%）=稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数×100%9.3结果判定 稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70% ，则可按该供试液制备方法和菌落计数法测定供试品的细菌、霉菌或酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。9.4验证试验可与供试品的细菌，霉菌及酵母菌计数同时进行。9.5注意事项9.5.1所用标准菌种的传代次数不得超过5代。以冷冻干燥的原始菌种开启后转种培养，其培养物为第一代。9.5.2黑曲霉菌的菌液制备将黑曲霉菌的孢子接种至真菌琼脂斜面培养基上，于20-25培养5-7天

24、，使大量的孢子产生。加入3-5ml的0.9%无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱。然后，用一支10ml无菌球形毛细吸管，其管口用无菌棉花或纱布包扎且能过滤菌丝的装置，吸出孢子菌液至无菌试管内，用比浊法，将菌液稀释至每毫升含10-100cfu。9.5.3做试验菌的回收率试验时，加入菌量以50-100cfu 为宜。加菌量过多，如薄膜法，菌落拥挤，则不好计数；加菌量过少，如小于30个，则误差大。10.检查法10.1平皿法10.1.1在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取该稀释级供试液各1ml至每个直径90mm 的灭菌平皿中，或从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管吸供试液各

25、 至每个灭菌平皿中。每一稀释级每种培养基至少注2-3个平皿（一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。一般取适宜的连续2-3个稀释级的供试液进行细菌、霉菌和酵母菌数测定。10.1.2阴性对照 待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取稀释剂（PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用ypd琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。10.1.3倾注培养基：将预先配制好的细菌计数用的营养琼脂培养基；霉菌、酵母菌计数用的

26、玫瑰红钠琼脂培养基；含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌）和琼脂培养基（酵母菌）溶化，冷至约45时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或逆时针方向快速旋转平皿，使供试液或稀释液与培养基混匀，置操作平台上待凝。在旋转平皿时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上。10.1.4培养：一般细菌计数平板倒置于30-35 培养箱中培养72h。霉菌、酵母菌计数平板倒置于20-25培养箱中培养120h。10.1.5菌落计数10.1.5.1一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落与供试品颗

27、粒、培养基沉淀物、气泡、油滴等的鉴别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察，或挑取可疑物涂片镜检。10.1.5.2供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。10.1.5.3供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多的有形物，且难与菌落相鉴别。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（1-2个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。或用0.001%TTC营养琼脂注皿，经培养后该培养基生长的菌落为红

28、色，衬于白色背景上易于点计细菌菌落和区分其他有形物。有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用0.001%TTC营养琼脂注皿。10.1.5.4若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状或片状、云雾状菌落，菌落间无明显界线时，一条链、片作为一个菌落计，但若链、片上出现性状与链（片）状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，其外缘有若干性状相似的单个菌落，一般不宜作为计数用。10.1.5.5若各稀释级2个平板菌落的平均数在15以上，同稀释级二平板菌落数

29、相差1倍时，该稀释级菌落数不得作为计数依据；当2个平板菌落均数在15（含15）以下时，两个平板菌落数的差值允许范围为0-4,1-7,2-9,3-10,4-12,5-14,6-15,7-17,8-18,9-19,10-20.超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。10.1.5.6菌落生长呈蔓延趋势者，细菌，霉菌需逐日作初步点计，在点计霉菌菌落时，轻轻翻转平板，勿反复翻转，否则使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差。10.1.5.7在48h点计细菌，120h点计霉菌时，如菌落极小，不易辨认，可延长培养时间至7天，再点计菌落数。10.1.5.8对有疑议的供试品以

30、YDP培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。10.1.5.9含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基点计霉菌数，YDP琼脂培养基点计酵母菌数。两者计数值合并报告。10.1.5.10在特殊情况下，若营养琼脂培养基上生长有霉菌和酵母菌其数量多于玫瑰红钠琼脂培养基上生长的霉菌和酵母菌，或玫瑰红钠琼脂培养基上生长的细菌数多于营养琼脂培养基上生长的细菌数，以菌落数多的培养基中的菌数报告结果。10.1.5菌数报告规则宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30-300之间、霉菌平均菌落数在30-100之间的稀释级，作为菌数报告的依据。10.1.6.1当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数

31、乘以稀释倍数的值报告菌数。10.1.6.2当有2个相邻稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值=(高稀释级平均菌落数×稀释倍数)/(低稀释级平均菌落数×稀释倍数) 而定。若比值小于或等于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告菌数；当出现比值大于5，甚至高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证10.1.6.3当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数.10.1.6.4如各稀释级的平板均无菌落生长，

32、或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以小于10报告菌数。10.2薄膜过滤法10.2.1取滤膜孔径不大于0.45m，直径不小于50mm可拆卸的滤器。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法进行灭菌。使用时，必须保证滤膜在过滤前后的完整性。10.2.2水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量不

33、宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。10.2.3每张滤膜取相当于1g或1ml 供试品的供试液直接过滤，或加至适量稀释剂中，混匀，过滤。若供试品1g或1ml含菌较多，可选适宜稀释级的供试液 ，过滤。用PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼胆培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长。10.2.4阴性对照试验 取试验用的稀释剂1ML同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。10.2.5培养和计数

34、培养及菌落计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不多于100 个。如菌落数超过100个，不便计数时，可取高稀释级的供试液同法操作，点计滤膜上的菌落数。10.2.6菌数报告规则 以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告；若滤膜上无菌落生长，以1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或1 乘以稀释倍数的值报告菌数。10.3培养基稀释法：取低稀释级供试液（原液或1:10供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或0.2ml），每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。每1ml供试液等量分注5个或 5个以上平板点计的菌落数之和，即为每1ml

35、的菌落数，共得2组数据。以2份低稀释级供试液菌落数的平均数乘以稀释倍数的值报告。10.4结果报告10.4.1菌落数在100以内时，按实有数据报告。10.4.2菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。10.5复试供试品细菌数、霉菌和酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应从同一批样品中随机重新取2倍包装量的供试品，依法作单项复试两次，以三次检验结果的均值报告。若3次结果的平均值不超过该品种项下的规定，判供试品符合规定；否则，判供试品不符合规定。11.注意事项11.1供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。11.

36、2供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过 小时。否则，可能导致微生物繁殖或死亡而影响计数结果。11.3供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试液，以免造成实验误差。11.4为避免细菌菌落蔓延生长，宜采取下列方法处理：11.4.1开盖干燥 将已凝固的琼脂平板开盖，倒置斜放于净化工作台上，开机后合盖，放入培养箱培养。11.4.2换陶瓦盖 将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。11.4.3加TTC于倾注培养基前，在每1000ml营养琼脂内加入灭菌1%TTC溶液1ml（最终浓度为0.001%），混匀后倾注平皿。12.检验报告书写本品按中国药典微生物限度检查法检验，结果符合或不符合规定。第二部分

37、：控制菌检查1.方法验证在建立供试品的控制菌检查法或原检查法的检验条件发生改变可能影响检验结果的准确性时，应对供试品的抑菌活性及检查法的可靠性进行验证。验证时，按各供试品微生物限度项下的规定（给药途径）选择相应的菌株，并按供试液的制备和控制菌检查法所规定的方法进行。2.仪器、设备及用具 见各控制菌检查项下。3.试液、指示液 见各控制菌检查项下。4.培养基 见各控制菌检查项下。5.验证用菌株及菌液制备5.1菌种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。5.2菌液制备 分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的营养琼脂斜面培养物少许，各接种至5m

38、l营养肉汤培养基内，置36±1培养18-24h，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10-100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18-24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成1ml含10-100cfu的菌液。6.供试液的制备见细菌、霉菌和酵母菌计数7 。7.验证方法7.1试验组 取规定量供试液及10-100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为试验菌。当采用薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中

39、，冲洗后，取出滤膜接种到增菌培养基中。7.2阴性对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌：验证铜绿单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。8结果判定 阴性对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法作该供试品的控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应参照细菌、霉菌和酵母菌计数7.8具抑菌活性的供试品项下操作，以消除供试品的抑菌活性。建立新的方法，并重新验证。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。第三部分：大肠埃希菌检查1简述

40、大肠埃希菌即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。用4甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）和靛基质试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、试验为阳性或阴性即可报告结果。原理：利用目标菌限定酶作用的

41、底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。2仪器、设备及用具2.1无菌室参照细菌、霉菌和酵母菌计数2.1.1 。2.2净化工作台。2.3培养箱（36±1）。2.4高压蒸汽灭菌器。2.5显微镜（1500×）。2.6微波炉。2.7恒温水浴（45±1 ）。2.8离心机（500-4000r/min）。2.9 0.45m±0.02m薄膜及过滤器。2.10电冰箱。2.11匀浆仪。2.12 365nm紫外灯。2.13玻璃器皿、器具参照细菌、霉菌和酵母菌计数2.2.2。3试液、指示液参见中国药典二部附录。4培养基参见中国药典二部附录。5对照用菌液，参见

42、控制菌检查5.2.6准备6.1供试液的制备6.2.1液体供试品见细菌、霉菌和酵母菌计数7.1 。6.2.2固体、半固体或黏稠液供试品见细菌、霉菌和酵母菌计数7.2。6.2.3非水溶性供试品见细菌、霉菌和酵母菌计数7.3 。6.2.4含抑菌成分供试品 供试品按常规检查法，加入规定量的对照菌，不能检出时，表明供试品有抑菌活性。该供试液须按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。同时做阳性和阴性对照。6.2.4.1稀释法 取规定量的供试液接种到较大体积的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。6.2.4.2离心沉淀集菌法 取规定量的供试液于无菌刻度离心管中， 3000r/min离心30

43、min，移去上清液，留底部集菌液约2ml，并稀释该供试液至原规定量。如有不溶性药渣，可先以500r/min离心5min，取全部上层液，再按上述方法集菌处理。6.2.4.3薄膜过滤法 取规定量的供试液于稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约47mm、孔径不大于0.45m±0.02m微孔滤膜的薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次不少于100ml，将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中。6.2.4.4中和法 取规定量含磺胺类的供试品，于 100ml增菌液（含1%对氨基苯甲酸约1-5ml）中；含砷、汞类的供试品，于硫乙醇酸盐培养基100ml中；含洗必泰供试品，于含适量

44、聚山梨酯80等表面活性剂的100ml增菌液中（表面活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌作用）。6.2.4.5沉降法 取规定量供试液，自然沉降5min，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌制剂。7.操作步骤7.1检验程序阳性对照试验 各供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10-100cfu，供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的各控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再做阳性对照。阴性对照试验 取稀释剂10ml加入100ml（或200ml）相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。7.2增菌培养

45、取胆盐乳糖培养基2份，每份各100ml。1份加入10ml供试液（相当于供试品1g、1ml 、10cm2 ），另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。培养18-24小时，必要时可延至48小时。阴性对照应无菌生长。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG 培养基的试管内，培养，于5、24小时在365nm紫外光下观察，同时用未接种的 培养基作本底对照。在紫外光下若管内培养物呈现蓝白色荧光，MUG为阳性；不呈现荧光，为MUG 阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供

46、试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。7.3分离培养 如呈现MUG阳性、靛基质阴性或MUG 阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品 增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1-2环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18-24h。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与中国药典二部所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。7.4纯培养 如EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与中国药典二部所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2-3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18-24h，作以下检查。如平板上无单个可疑菌落，但有

47、可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于EMB琼脂平板，培养18-24h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。7.5革兰染色、镜检7.5.1以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2-3次（载玻片不烫手）固定。7.5.2滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。7.5.3滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。7.5.4滴加95%乙醇，脱色 ，水洗。7.5.5滴加沙黄染液，复染 ，待干后，镜检。7.5.6染色结果7.5.6.1革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色

48、。7.5.6.2大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。7.5.7注意事项7.5.7.1玻片必须洁净，无划痕。涂片的菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连成片。不利菌细胞染色反应判断及形态观察。7.5.7.2培养物的菌龄以16-24h为宜。培养时间过长，革兰阳性菌易染成红色。7.5.7.3脱色是关键。脱色时间不足，菌细胞易染成阳性；脱色时间过长，菌细胞易染成阴性。7.5.7.4可用已知革兰染色为阳性、阴性的菌种做染色的质量控制。8.生化试验8.1乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养18-24h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），

49、产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种 乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于出现阳性。或适当延长培养时间。8.2靛基质试验（I） 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24-48h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24h即可出现阳性结果。常以无菌操作先从管中取出1ml或2ml培养液进行检查，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24h，作靛基质试验。8.3甲基红试验（M） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于培养

50、液中加入甲基红指示液2-3滴（约每1ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。8.4乙酰甲基甲醇生成试验（VP）取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于2ml培养液中加入。萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h（通常在30min）内出现红色判为阳性，无红色反应为阴性。8.5枸橼酸盐利用试验（C） 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面培养基上，培养2-4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔 生长为阴性。9.结果判定9.1当阴性对照

51、试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。9.2MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为-+-、革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG 阴性、靛基质阳性、IMViC 试验为+-、革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。9.3供试品培养物检查不符合9.2中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。9.4当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长但非大肠埃希菌，不能做出检验报告。10.注意事项10.1MUG法不必从混合菌中

52、分离单个菌落。除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性。因此，在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠的量，可排除革兰阳性菌的干扰。至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出亦判为不合格。10.2配制MUG培养基时，务必校正PH值，灭菌后PH不得过7.4，否则PH值偏高，MUG分解，本身则显荧光；分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光。10.3培养时间 供试品培养液接种于MUG培养基中，一般培养5h和24h要观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至48h再观察结果。由于大肠埃希菌

53、各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；PH值的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。10.4结果观察 取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强的蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。供试品MUG管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置（阴性管居中），适当倾斜试管。如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦可移去阳性对照管。10.5药品中污染的大肠埃希菌，易受生产工艺及药物的影响。在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征时有变化，挑取可

54、疑菌落往往凭经验，主观性较大，务必挑选个以上菌落分别做IMViC试验鉴别，挑选菌落越多，检出阳性菌的机率越高，如仅挑选一个菌落做IMViC试验鉴别，则易漏检。10.6在IMViC试验中，以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。枸橼酸盐利用试验培养时间，原订为2天，根据试验资料，发现培养3天后，枸橼酸盐利用试验产生阳性。仅培养2天是不够的，故试验培养时间改为2-4天。10.7以IMViC试验来判断大肠埃希菌属中的大肠埃希菌是含混的，有可能把埃希菌属的其他种判为大肠埃希菌。IMV

55、iC试验为+-者，除大肠埃希菌外，还有非活跃大肠埃希菌、弗格森埃希菌、赫尔曼埃希菌。IMViC试验为-+-者，除大肠埃希菌外，还有非活跃大肠埃希菌、伤口埃希菌、蟑螂埃希菌。10.8在各类供试品中检测大肠埃希菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复验。检出的大肠埃希菌及其他控制菌培养物须保留1个月，备查。10.9生化试验也可采用商品化的自动分析仪器进行、仪器可以给出菌种的鉴定结果，做相应报告。第四部分：大肠菌群1.简述 大肠菌群是指37生长时能发酵乳糖，在24小时内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌。符合上述定义的细菌除大肠埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属等菌属的菌种

56、。大肠菌群包括了正常人畜肠道内的全部需氧的革兰阴性杆菌。以大肠菌群作为卫生指示菌比大肠埃希菌具有广泛的卫生学意义。因此，国际上以大肠菌群作为药品、食品、饮水等的卫生指示菌，对卫生质量的要求更严格。大肠菌群的检查通过增菌、分离、革兰染色、镜检和确证试验等步骤。2.仪器、设备及用具（见大肠埃希菌）。3.试液、指示液（见大肠埃希菌）。4.培养基参见现行中国药典二部5.对照用菌液（大肠埃希菌，同控制菌方法验证5.2）。6.操作步骤6.1操作程序供试品供试液胆盐乳糖发酵培养基产酸产气EMB或MaCI平板乳糖发酵培养基产酸产气报告6.2增菌培养 取不少于10ml胆盐乳糖发酵培养基管3支，加入1:10供试液

57、1ml（含供试品1g或0.1ml）； 稀释的供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml）和1:1000稀释的供试液1ml(含供试品0.001g或0.001ml ）。取1支胆盐乳糖发酵培养基10ml管，加入稀释剂1ml作为阴性对照。均培养18-24h小时，观察结果。加供试液的胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，则判该管未检出大肠菌群。若胆盐乳糖发酵管产酸产气，应进一步分离培养。6.3分离培养 将上述产酸产气的发酵管中的培养物，分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂 培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18-24h小时。大肠菌群的菌落在曙红亚甲蓝琼脂培养基平板上呈紫黑、紫红、红或粉红色，圆形，扁平或凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润；在麦康凯琼脂培养基的平板上呈鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。若平板上无菌落生长，或生长的菌落与上述菌落特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长有上述菌落形态特征或疑似菌落，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。6.4确证试验 从上述分离平板上挑选4-5个疑似菌落，接种于乳糖发酵管中，培养 小时24-48h。若产酸产气，判