丁香精油与冷等离子体协同去除蔬菜表面大肠杆菌O157：H7生物膜研究

1、 本 科 毕 业 论 文丁香精油与冷等离子体协同去除蔬菜表面大肠杆菌O157:H7生物膜的研究Synergetic antibacterial efficacy of cold nitrogen plasma and clove oil against Escherichia coli O157:H7 biofilms on vegetables 学院名称： 食品与生物工程学院 专业班级： 食品科学与工程1201 学生姓名： 指导教师姓名： 指导教师职称： 2016年 6 月 丁香精油与冷等离子体协同去除蔬菜表面大肠杆菌O157:H7生物膜的研究摘要 本文旨在研究冷等离子体与丁香精油协同作用对

2、新鲜蔬菜表面大肠杆菌O157:H7生物膜的清除效果。首先本实验分别使用不同浓度的丁香精油（1 mg / mL，2 mg / mL和4 mg / mL）和不同功率条件下冷等离子体（400-600 W）对大肠杆菌O157:H7生物膜进行抗菌实验。试管实验结果显示，丁香精油与冷等离子体在一定条件下对大肠杆菌O157:H7生物膜都有明显清除作用（P < 0.001）。随后，本实验研究了协同作用的抗生物膜效果，协同作用与丁香精油和冷等离子体单独作用相比，丁香精油与冷等离子体协同作用对生物膜的清除效果更加显著。通过激光共聚焦电子显微镜（CLSM）和扫描电子显微镜（SEM）直观地观察到，丁香精油与冷等

3、离子体协同作用对大肠杆菌O157:H7生物膜具有极好的清除效果。当丁香精油与冷等离子体协同作用应用于新鲜蔬菜表面杀菌时，在低浓度丁香精油作用的条件下，利用400 W条件下冷等离子体协同清除蔬菜表面生物膜，清除生物膜的能力得到显著提高，丁香精油与冷等离子体协同作用能够更加有效地清除生物膜。最后，通过感官评价实验说明，丁香精油与冷等离子体协同作用对生菜的品质只有轻微的负面影响。此外，丁香精油和冷等离子两种杀菌方法均会破坏细菌的细胞壁和细胞膜，导致细胞内成分泄漏，如核酸、ATP等物质。本研究表明，丁香精油和冷等离子体能够通过协同作用有效地抑制新鲜蔬菜表面的病原菌生物膜生长。关键词：生物膜，冷等离子体

4、，丁香精油，协同抑菌作用，大肠杆菌O157:H7，蔬菜Synergetic antibacterial efficacy of cold nitrogen plasma and clove oil against Escherichia coli O157:H7 biofilms on vegetablesABSTRACT This study aims to evaluate the antimicrobial effects of cold nitrogen plasma (CNP) and clove oil against Escherichia coli O157:H7 (E. co

5、li O157:H7) biofilm on fresh vegetables. Both clove oil (1 mg/mL, 2 mg/mL and 4 mg/mL) and CNP (400-600 W) displayed significant eradication effect on E. coli O157:H7 biofilms in vitro (P < 0.001). Subsequently, the antibiofilm effect of combined treatment was studied as well. Compared with the r

6、espective treatment, combined treatment exhibited remarkable synergistic effect on eradicating E. coli O157:H7 biofilms. The confocal laser scanning microscopy (CLSM) and scanning electron microscopy (SEM) had also visually testified that the antibacterial effects of clove oil on E. coli O157:H7 bio

7、films (in vitro and on fresh vegetables) were enhanced by CNP at 400 W for short treatment duration. The results of sensory evaluation indicated that combined treatment had mild negative effect on lettuce quality. Moreover, the synergetic antibacterial mechanism of clove oil and CNP against E. coli

8、O157:H7 was concluded as that they could damage the bacterial cell wall and the outer membrane, leading to leakage of cellular components, such as nucleic acid and ATP. The research indicated that clove oil and CNP in combination was an effective method on protecting against the growth of pathogens

9、on fresh vegetables.Keywords: Biofilms，Plasma，Clove oil，Synergetic antibacterial effect，Escherichia coli O157:H7，Vegetables目录第一章 绪论11.1国内外蔬菜产品安全性问题11.1.1蔬菜的安全性问题及常见细菌11.1.2蔬菜中的大肠杆菌O157:H711.1.3蔬菜中的大肠杆菌O157:H7生物膜21.2丁香精油的抗菌活性及其在食品中的应用21.2.1丁香精油的简介21.2.2丁香精油的抗菌活性研究21.2.3丁香精油的抗菌机制研究31.2.4丁香精油在食品中的应用31.

10、3冷等离子体的杀菌性能及其在食品中的应用41.3.1冷等离子体的简介41.3.2冷等离子体的杀菌性能研究41.3.3冷等离子体的杀菌机制研究41.3.4冷等离子体在食品中的应用51.4立体依据及意义51.5研究内容6第二章 丁香精油抗菌活性及机制研究72.1引言72.2材料与仪器72.2.1 材料与试剂72.2.2 实验仪器82.3实验方法82.3.1丁香精油MIC和MBC、MBIC和MBEC的测定82.3.2丁香精油的杀菌曲线测定92.3.3丁香精油的清除生物膜性能评价92.3.3.1 MTT染色法测定生物膜的杀菌效果92.3.3.2平板菌落计数法测定丁香精油生物膜的杀菌效果92.3.3.3

11、场发射扫描电子显微镜观察结果102.3.4丁香精油对大肠杆菌O157:H7的杀菌机制102.3.4.1大肠杆菌O157:H7细胞形态变化测定102.3.4.2大肠杆菌O157:H7胞内物质游离程度测定102.3.4.3大肠杆菌O157:H7胞内DNA含量的测定112.3.4.4大肠杆菌O157:H7胞内ATP含量的测定112.4实验结果与讨论112.4.1丁香精油的MIC和MBC112.4.2丁香精油的MBIC和MBEC122.4.3丁香精油的杀菌曲线132.4.4不同条件下对生物膜的清除结果132.4.5大肠杆菌O157:H7细胞形态变化162.4.6大肠杆菌O157:H7胞内物质游离程度变

12、化162.4.7大肠杆菌O157:H7胞内DNA含量的变化172.4.8大肠杆菌O157:H7胞内ATP含量的变化.182.5本章小结18第三章 冷等离子体杀菌性能及机制研究193.1引言193.2材料与仪器193.2.1 材料与试剂193.2.2 实验仪器203.3实验方法203.3.1 MTT染色法测定203.3.2平板菌落计数法测定203.3.3 DAPI荧光染色法测定213.3.4冷等离子体对大肠杆菌O157:H7的杀菌机制213.3.4.1大肠杆菌O157:H7细胞形态变化测定213.3.4.2大肠杆菌O157:H7胞内物质游离程度测定213.3.4.3大肠杆菌O157:H7胞内DN

13、A含量的测定213.3.4.4大肠杆菌O157:H7胞内ATP含量的测定223.4实验结果与讨论223.4.1不同功率条件下处理对生物膜的清除结果223.4.2不同时间条件下处理对生物膜的清除结果233.4.3 DAPI荧光染色法测定结果233.4.4大肠杆菌O157:H7细胞形态变化243.4.5大肠杆菌O157:H7胞内物质的游离程度变化253.4.6大肠杆菌O157:H7胞内DNA含量的变化263.4.7大肠杆菌O157:H7胞内ATP含量的变化.263.5本章小结27第四章 丁香精油与冷等离子体协同作用284.1引言284.2材料与仪器284.2.1 材料与试剂284.2.2 实验仪器

14、284.3实验方法294.3.1 MTT染色法测定协同作用对生物膜的杀菌效果294.3.2菌落计数法测定协同作用对生物膜的杀菌效果294.3.3 DAPI荧光染色法测定294.4实验结果与讨论304.4.1协同作用对大肠杆菌O157:H7生物膜清除结果304.4.2 DAPI荧光染色法测定结果304.5本章小结31第五章 丁香精油与冷等离子体协同作用于蔬菜实验325.1引言325.2材料与仪器325.2.1材料与试剂325.2.2实验仪器325.3实验方法335.3.1菌落计数法测定协同作用对生物膜的清除效果335.3.2场发射扫描电子显微镜观察335.3.3感官评价测定345.4实验结果与讨

15、论345.4.1协同作用对不同蔬菜表面生物膜的清除结果375.4.2场发射扫描电子显微镜观察结果385.4.3感观评价测定结果385.5本章小结39第六章 结论与展望406.1主要结论406.2工作展望40参考文献42致谢46个人基本情况及大学期间个人小结47缩略词第一章 绪论1.1国内外蔬菜产品安全性问题1.1.1蔬菜的安全性问题及常见细菌目前，国内外皆有大规模的食物中毒疫情发生。其中大部分疫情都是因食用被细菌污染的蔬菜而引起的。1994年美国亚特兰大州发生了一次因大肠杆菌导致的大面积人群的出血性肠炎症状1。2005年，瑞典暴发了由于食用被大肠杆菌O157污染的莴苣而引发的疫情。2006年美

16、国发生“毒菠菜”事件，多数美国人因食用含有被大肠杆菌污染的生菠菜，而爆发遍及美国多个州的疫情2。2006年，韩国报道出由大肠杆菌引起的出血性腹泻并引发溶血性尿毒综合征的病例3。2011年5月，西班牙游客在德国食用黄瓜后出现腹痛、腹泻、呕吐等症状。随后送往医院，被诊断为大肠杆菌感染所致的出血性腹泻4。由微生物引起蔬菜污染的问题已经成为人们所关注的焦点。不少研究人员发现，蔬菜中常见的细菌主要有：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），绿脓杆菌（Pseudomon

17、as aeruginosa），大肠杆菌（Escherichia coli），肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）和短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）等5。其中大肠杆菌O157:H7是近年来感染性腹泻病原体中影响最为广泛、危害最为严重的细菌之一。1.1.2蔬菜中的大肠杆菌O157:H7肠埃希氏菌通常称为大肠杆菌，广泛分布于自然界。其中大肠杆菌O157:H7是能够引起人类严重疾病的肠道细菌。它是一种革兰氏阴性短杆菌，代谢属于兼性厌氧型。大肠杆菌O157:H7周身鞭毛，能运动，无芽孢 6。大肠杆菌O157:H7可以通过污染食物向人类传播，从而引发出血性腹泻与肠炎等。严

18、重时还有肾衰竭，溶血性尿毒症等症状 7。章迎春等人于2000年10月对福建省福州市销售的果蔬类食品共1680份进行了连续1年的监测。结果发现福州市部分果蔬食品被大肠杆菌O157:H7污染，导致人们食用后身体不适8。之后，胡俊峰等对2001年8月厦门市市场上销售的蔬菜类食品进行抽查检测。结果发现该地区发生的肠出血性疾病与蔬菜受大肠杆菌O157:H7污染有很大关系9。 1.1.3蔬菜中的大肠杆菌O157:H7生物膜生物膜是一种聚合体，它们黏附在生物或非生物表面。生物膜是由细菌和菌体的基质组成的10。大肠杆菌O157:H7生物膜是由大肠杆菌O157:H7聚集形成，对人类危害极大。因为生物膜可看作微生

19、物的一种生物屏障，所以由生物膜引起的污染很难清除。因此，与浮游菌相比生物膜上的细菌表现出更好的抗药性11。大肠杆菌O157:H7生物膜污染农产品既有内因又有外因 12。多数是由于大肠杆菌O157:H7从植物的伤口、气孔等处进入，在植被的表面与其他微生物相互作用生成生物膜。大肠杆菌O157:H7也可通过污染的水源传播给人类，如污染灌溉水会导致食物污染等13。因人们食用大肠杆菌O157:H7生物膜污染的果蔬而发生的疫情屡见不鲜。现代技术可以通过物理性、化学性、生物性等方法杀灭蔬菜中大肠杆菌O157:H7生物膜。例如利用纳米TiO2光杀灭大肠杆菌O157:H7生物膜，利用高压CO2杀灭大肠杆菌O15

20、7:H7生物膜等14。但是这些方法并不适用于新鲜蔬菜表面生物膜污染处理，因此有效清除新鲜农产品的细菌生物膜的方法还有待探究。1.2丁香精油的抗菌活性及其在食品中的应用1.2.1丁香精油的简介丁香精油是从丁香植被作物中提取出的具有芳香风味的物质。丁香精油主要是将丁香树脂、丁香树叶、丁香花朵、丁香果实等经过萃取、蒸馏、挤压等一系列方式提炼15。丁香精油呈黄色或无色，甜而温暖。丁香精油的主要成分是丙酮类、醇类、醛类、酚类等。目前，杀灭病菌性微生物的方法多种多样。防治果蔬采后病害的主要方法是使用化学杀菌剂杀菌，但由于化学杀菌剂具有残留量较高、毒性较大、污染环境等负面效应，寻找一种安全、有效、对环境无污

21、染或是污染小的杀菌剂就显得日趋迫切。丁香精油作为一种果蔬采后病害的天然杀菌剂，由于其较强的抑菌活性和对环境无污染等特点引起了人们的关注。1.2.2丁香精油的抗菌活性研究由于丁香精油及其有效成分具有较好的抑菌效果，很多学者对丁香精油的抗菌活性进行了研究。疏秀林等人关于丁香精油对常见病菌微生物的抗菌效果做出研究。结果表示，丁香精油在体外的抗菌实验中，较低浓度下就能够达到抑菌甚至杀死病菌的效果16。李凤清等人测定了丁香精油对5种霉菌的最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。结果显示，丁香精油有明显的抗霉菌作用17。刁文睿等人发现，丁香精油对金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用。当丁香精油浓度为0

22、.5 mg/mL时甚至更低时表现出抑菌作用，当丁香精油浓度为1 mg/mL时表现出杀菌作用。随着温度降低，只有提高相应的抑菌浓度和杀菌浓度才能达到相同的抑菌、杀菌效果18。崔海英等人着重研究了丁香精油对单增李斯特菌的抗菌效果。经实验测得发现，丁香精油对单增李斯特菌的最小抑菌浓度是0.5 mg/mL，最小杀菌浓度是1 mg/mL。用丁香精油浓度为0.5 mg/mL作用8 h后，对李斯特菌清除效果达到99.996%19。1.2.3丁香精油的抗菌机制研究关于丁香精油的抗菌机制，不少学者对此进行了研究。Hoskins 20等人研究了丁香精油对绿脓杆菌的抗菌机制。实验发现，丁香精油主要是通过改变绿脓杆菌

23、细胞形态结构从而对其产生影响。丁香精油中的活性成分会使绿脓杆菌的细胞膜、细胞壁和细胞器等结构发生改变。从而造成了细胞的不可逆性损伤和破裂，最终导致了菌体死亡。方爱娟等的研究发现，丁香精油成分中的-蒎烯可以抑制大肠杆菌O157:H7生物膜的生长，使大肠杆菌O157:H7生物膜对杀菌剂的敏感度增加，从而起到抑制作用21。 1.2.4丁香精油在食品中的应用近年来，随着环保法规日益严格，人们消费水平及生活水平的提高，人们更加注重健康，崇尚自然22。尤其是在食品加工等方面，也越来越趋向于向“绿色”和“天然”等方向的转变。在这种大形势下，研制开发出一些低毒的、天然的、新型的抗菌防腐剂无疑成为了国内国外抗菌

24、领域的研究热门。在食品行业，最重要的食品添加剂之一是防腐剂。目前国内外使用的大多均是化学合成防腐剂，然而化学防腐剂存在众多问题，具有致癌性、致畸性等缺点。这些问题已经引起了社会和舆论的广泛关注23。所以，研发一种自然的、安全的、功能性的食品防腐保鲜剂显得尤为重要。如今人们已经越来越多的关注食品的健康和安全，从而对天然食品添加剂抱有厚望。因此，研究开发出天然、健康、多功能的食品添加剂是现在及未来食品工业的发展前进方向。基于以上讨论，丁香精油作为天然防腐保鲜剂的重要来源，具有非常广阔的发展应用前景。1.3冷等离子体的杀菌性能及其在食品中的应用1.3.1冷等离子体的简介冷等离子体一词源于Plasma

25、，源于希腊语。冷等离子体是一种集合体，它由离子、电子和原子等组成的。它们所带正负电荷总数相等，所以整体呈电中性24。等离子体实际上就是在较强的电磁场条件下产生的一种电离气体。它又被称为物质的第四种状态，是一种独特的杀菌介质。冷等离子体杀菌作为一种新兴的广谱灭菌技术，对多种类型细菌、真菌类病原菌均具有较好的清除效果25。冷等离子体具有灭菌时间短、不产生有毒物质、成本低等优点，不仅可以保障环境和操作人员安全，而且可以实现灭菌技术的“绿色化”26。1.3.2冷等离子体的杀菌性能研究现如今食品的微生物污染越来越严重，解决这个问题也成为食品安全卫生界的难题。很多研究人员关注到了冷等离子体，顾春英等人用等

26、离子体对水中微生物进行杀菌，作用15 min后，发现对水中的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀灭率达到99.927。孙岩洲等人利用介质阻挡放电处理枯草杆菌芽孢，发现细菌外层结构破损以及体积缩小28。姜玉等人研究低温等离子体针对口腔变形链球菌及其生物膜的杀灭效果，发现琼脂培养基平板上变形链球菌经低温等离子体针处理后形成直径约7 mm的圆形杀菌圈29。马虹兵等通过向液体中鼓泡（通入空气和纯氧），同时将电场直接作用于液体与气体的混合态而成功地杀灭了苹果表面的大肠埃希氏菌和沙门氏菌30。 1.3.3冷等离子体的杀菌机制研究关于冷等离子体的杀菌机理，至今为止还没有一个比较圆满的答案。不过不少研究人员通过实验相

27、继从物理学以及化学方面对冷等离子体的杀菌机理提出了一些相关假说。孟月东等人提出，冷等离子体杀菌是气体在加热或强电磁场作用的条件下电离产生紫外线引起。产生的紫外线作用于微生物，从而引起微生物的死亡31。Mainil等人研究带电粒子在杀菌过程中的作用机制,实验发现带电粒子积累在细胞膜外表面。带电粒子使细胞膜产生超过自身张力的静电力,从而引起细胞的破裂32。韩黎等人在实验中也发现冷等离子体可以在强磁场条件下电离产生紫外线，产生的紫外光子具有光解微生物分子化学键的作用。结果表明通过冷等离子体作用微生物，可以直接破坏其蛋白质、核酸等大分子的物质，使微生物死亡33。1.3.4冷等离子体在食品中的应用冷等离

28、子体杀菌由于具有低温、高效、环保等特点，被广泛应用在食品工业中的原材料和设备中。目前，食品工业化生产仍主要应用热杀菌。实验室中已经对冷杀菌技术进行了一定的研究，并不断改进。金英关于常见低温等离子体对酵母菌的杀灭作用进行了研究，主要对金针菇表面的酵母菌进行等离子体杀菌实验。实验结果表明，短时间处理对金针菇表面的酵母菌具有明显清除效果34。周宇英等35对等离子体杀灭大肠埃希氏菌的机制进行了研究，得出菌体死亡与细胞膜和细胞壁的破裂有关。杨丽莉等人研究绿茶提取物和大气等离子射频的协同作用对鲜切火龙果病原体的影响，实验发现细菌容易通过气孔进入叶片开口，且细菌易在火龙果表面高粗糙度处堆积。另外结果表明，相

29、比单独处理，协同作用对病原体生长的抑制效果明显增强，并且延长火龙果的保质期36。1.4立题依据与意义尽管植物精油具有有效的抑菌作用，是一种安全有效对环境污染小的方法，但是精油实际应用在食品上时，要想达到和试管实验相同的抗菌效果，则需要较高的浓度和较长的作用时间。并且对于不同的细菌微生物，植物精油的作用剂量也不同。对于不同温度下保存的食品，精油的抗菌效果也不同。然而冷离子体作用微生物，可以达到高效灭菌的效果。同时冷等离子体灭菌是一种安全环保的方法。近年来世界多地都发生了严重食物中毒事件，其中大肠杆菌O157:H7引起的疾病爆发占很高比例。细菌感染性疾病多与生物膜的形成有关，很多研究都发现微生物在

30、蔬菜表面形成生物膜，人们食用被细菌污染的蔬菜从而感染疾病36。20世纪初美国、加拿大、英国、等国家多次发生因蔬菜中大肠杆菌O157:H7生物膜污染引起的出血性肠炎与感染性腹泻37。因此研究精油与冷等离子体协同去除蔬菜表面大肠杆菌O157:H7生物膜具有深远的意义。同时本实验研究了丁香精油及等离子体单独的抗菌活性以及两者的协同作用在蔬菜中的应用，对研发其他种类型的抗菌剂与冷等离子体的协同作用在食品中的应用也有很大的帮助作用。1.5研究内容本论文研究了丁香精油与冷等离子体协同去除蔬菜表面大肠杆菌O157:H7生物膜的抗菌活性，以及两者在作用过程中对细菌的破坏机制。主要包括以下内容： （1）通过两倍

31、稀释法测定丁香精油的最小抑菌浓度、最小杀菌浓度、最小抑制生物膜浓度、最小清除生物膜浓度。通过平板菌落计数法测定残存菌数，观察丁香精油在不同时间对游离大肠杆菌O157:H7的灭活作用。此外分析了丁香精油在不同浓度及不同处理时间的抗菌性能。（2）通过透射电镜观察细胞经丁香精油作用前后形态变化，测定丁香精油作用前后OD260、ATP含量、DNA含量指标来研究丁香精油对大肠杆菌O157:H7的杀菌机制。（3）通过MTT染色法与平板菌落计数法测定不同功率与不同作用时间条件下冷等离子体对大肠杆菌O157:H7生物膜的清除效果。（4）通过SEM观察冷等离子体对细菌形态的影响，最后通过测定OD260、ATP含

32、量、DNA含量指标来进一步探讨冷等离子体对大肠杆菌O157:H7的杀菌机制。（5）通过MTT染色法与平板菌落计数法评价丁香精油与冷等离子体协同作用清除大肠杆菌O157:H7生物膜。同时借助于激光共聚焦显微镜观察协同处理对生物膜的清除作用。（6）将协同杀菌作用应用于生菜、黄瓜、菠菜、青椒，利用菌落计数法评价协同杀菌是否能有效应用于不同蔬菜表面，达到清除大肠杆菌O157:H7生物膜的目的。第二章 丁香精油抗菌活性及机制研究2.1引言丁香精油是从丁香花蕾、丁香叶子等提取的精油，为我国 GB2760-2011食品添加剂使用标准规定允许使用的食用香料38。在食品工业中主要用于肉类、甜点、糕饼、腌制食品的

33、调味料，并且具有抗细菌、抗真菌、抗氧化等作用。但是，目前国内在丁香精油对生物膜的抑制作用的相关研究甚少。本文利用两倍梯度稀释法测定丁香精油对大肠杆菌O157:H7的MIC，MBC，MBIC和MBEC。研究丁香精油的杀菌效果与作用时间及作用浓度的关系，并通过SEM观察丁香精油对大肠杆菌O157:H7形态的影响。最后通过测定OD260、ATP、DNA指标来进一步探讨丁香精油对大肠杆菌O157:H7的杀菌机制。2.2材料与仪器2.2.1 材料与试剂表2.1 材料Tab.2.1 Material2.2.2 实验仪器表2.2仪器Tab.2.2 Instrument2.3实验方法2.3.1丁香精油MIC和

34、MBC、MBIC和MBEC的测定本实验测定了丁香精油的抗菌活性，主要通过两倍梯度稀释法测出丁香精油对大肠杆菌O157:H7的MIC（最小抑菌浓度）和MBC（最小杀菌浓度）。首先，通过等比稀释在试管中获得不同浓度（0.25 mg/mL，0.5 mg/mL，1 mg/mL，2 mg/mL和4 mg/mL）的丁香精油。每个梯度试管中接入0.1 mL（104-105 CFU/mL）菌液，不加菌液的作为阳性对照。在37 、150 rpm的条件下振荡培养24 h后，与阳性对照相同，摇晃后澄清的样品中浓度最小的即为MIC。此时从澄清透明的样品中各取一接种环样品，划线接种到NA培养基上，在37 条件下培养24

35、 h，无菌落生长的最小浓度即为MBC。以上实验重复3次。按上述操作，确定丁香精油的MIC和MBC39。 在无菌的TSB液体培养基中分别添加不同浓度的丁香精油，使丁香精油的最终浓度分别为0.25 mg/mL，0.5 mg/mL，1 mg/mL，2 mg/mL和4 mg/mL，并接入大肠杆菌O157:H7菌（104-105 CFU/mL）。在37 条件下静置培养48 h。通过MTT法定量细菌数量，无蓝紫色呈现的最低浓度为MBIC。测定MBEC的步骤如下，首先在48孔板中培养生物膜。将400 L无菌TSB加到48孔板，并接入大肠杆菌O157:H7（105-106 CFU/mL）于其中。将48孔板置于

36、25 的恒温培养箱中静置培养，培养1 d后轻轻吸除孔中上部的培养基及悬浮细菌，用无菌PBS轻轻清洗三次，更换新的TSB 。此步骤每天重复一次，培养5 d，尽量使得孔板底部和周围形成较多的生物膜。培养结束后，用无菌PBS清洗掉游离细菌，加入不同浓度的丁香精油，同时设置相应的不加精油的对照组。加入不同浓度的丁香精油，静置作用24 h。经不同浓度的丁香精油处理后，用MTT法染色未灭活的细菌，未出现明显颜色变化的最小丁香精油浓度定义为MBEC。2.3.2丁香精油的杀菌曲线测定将大肠杆菌O157:H7接种到液体培养基中，在37 的摇床中振荡培养24 h，获得对数生长期的细菌。取适量对数期的大肠杆菌O15

37、7:H7于生理盐水中，然后加入丁香精油，使试管中的精油浓度为1 mg/mL。同时另取一组不加丁香精油作为对照。放入37 、150 rpm的水浴摇床中振荡培养，分别取0 h，0.5 h，1 h，2 h，4 h和8 h的培养液，使用十倍稀释法稀释。然后取100 L于无菌固体平板培养基上，涂布均匀放入37 培养箱箱中倒置培养。24 h后对平板进行菌落计数，计算出不同时间培养液中的活菌总数，对精油的抗菌活性进行评价。 2.3.3丁香精油的清除生物膜性能评价2.3.3.1 MTT染色法测定生物膜的杀菌效果在48孔板中培养大肠杆菌O157:H7生物膜。培养结束后，用无菌PBS清洗掉游离细菌，加入不同浓度的

38、丁香精油，同时设置相应的不加精油的对照组。将48孔板在37 的恒温培养箱中静置培养不同时间后，去除悬浮菌，并用200 L PBS清洗三次。在孔板中加入100 L浓度为1 mg/mL 的MTT试剂，在37 条件下静置培养4 h后，加入细胞溶解液100 L，37 静置培养4 h。之后将样品在570 nm处测定其吸光度值。同时实验设置5个重复，将实验操作重复两次40。2.3.3.2平板菌落计数法测定生物膜的杀菌效果不锈钢片（2 cm×2 cm）浸泡在无水乙醇中超声清洗4 h，用蒸馏水清洗干净后，121 灭菌15 min。将无菌不锈钢片加入接有大肠杆菌O157:H7（105 CFU/mL）的

39、TSB培养基中，25 静置培养5 d，期间每天更换一次新鲜TSB。5 d后将不锈钢片取出，用无菌PBS清洗三次，放入无菌的培养皿中。将不锈钢片取出，加入含有不同浓度丁香精油的无菌PBS中作为实验组，将无菌不锈钢片加入未加精油的PBS中作为对照组。37 静置培养不同时间。处理后，将不锈钢片取出，用无菌PBS清洗三次，放入含有1 mL PBS的试管中,超声10 min，使不锈钢片上的生物膜脱落形成菌悬液。将得到的1 mL菌悬液十倍梯度稀释，采用对菌悬液中活菌数进行测定。每个测定重复三次取平均值。2.3.3.3场发扫描电子显微镜观察丁香精油的抗生物膜性能首先将无菌尼龙片（2 mm×2 mm

40、）加入TSB中并接入大肠杆菌O157:H7（104 CFU/mL），之后在37 条件下静置培养48 h。再将尼龙片取出，用无菌PBS清洗三次后，在1 mg/mL浓度的丁香精油中37 静置培养24 h。不加精油作用的尼龙片作为对照。将尼龙片取出，用无菌PBS清洗三次后，在场发射扫描电子显微镜下观察生物膜变化情况41。2.3.4丁香精油对大肠杆菌O157:H7的杀菌机制2.3.4.1大肠杆菌O157:H7胞内形态变化测定将培养至对数生长期的大肠杆菌O157:H7接种到NB液体培养基中，然后加入浓度为1 mg/mL的丁香精油，在37 的摇床中振荡（150 rpm）培养24 h。之后取一滴样品滴在无菌

41、平板上。取一片铜网与样品表面接触，静置3-5 min后取出，用滤纸条吸除铜网上多余的液滴，晾干一段时间。滴一小滴30 mg/mL磷钨酸溶液于无菌平板上，将吸附有菌液的铜网浸入磷钨酸溶液中，静置3-5 min。之后将铜网取出，用滤纸条吸除铜网上多余的液滴，放置在白炽灯下晾干。用TEM观察晾干后的铜网。另取不加丁香精油的菌体样液为对照样42。2.3.4.2大肠杆菌O157:H7胞内物质游离程度测定首先，将大肠杆菌O157:H7在37 下振荡培养24 h。培养后，悬浮液在4 下以4000 rpm离心15 min，将沉淀物收集。然后将沉淀洗涤三次，并悬浮在0.03 M的PBS（pH 7.2）中。随后将

42、1 mg/mL的精油加入悬浮液中，并在37 下振荡培养20 h。之后将悬浮液在4 以4000 rpm离心15 min，取上清液通过紫外分光光度法测定上清液在260 nm处的吸收。未加入精油而加入等量无菌水的处理作为空白对照43。2.3.4.3大肠杆菌O157:H7胞内DNA含量的测定将培养至对数生长期的大肠杆菌O157:H7放入PBS中，然后加入1 mg/mL的丁香精油，在37 的全温空气摇床中振荡（150 rpm）培养24 h。另取不加丁香精油的菌体样液为对照样。采用试剂盒提取大肠杆菌O157:H7内的核酸，经过简单的预处理之后分离纯化。然后采用硅基质膜吸附DNA，可在低盐高pH值条件下将D

43、NA洗脱下来。最后用微量紫外分光光度计测定大肠杆菌O157:H7内DNA含量变化44。2.3.4.4 大肠杆菌O157:H7胞内ATP含量的测定将生长至对数期的大肠杆菌O157:H7（108 CFU/mL）离心（4000 rpm，15 min），去除上清液后，用无菌PBS将细菌清洗三次，再加入等量的PBS，振荡均匀后分别均匀分装于两支试管中。取一只试管加入1 mg/mL丁香精油，未加精油的试管作为对照，37 振荡培养1 h后，离心（4000 rpm，15 min）后去除上清液，加入无菌PBS。在样品中加入等体积浓度为0.5 mg/mL的苯扎溴铵（破胞剂），加热煮沸4 min，使细胞裂解45，用

44、ATP荧光检测仪检测样品中的ATP含量。2.4实验结果与讨论2.4.1丁香精油的MIC和MBC本实验测定了丁香精油的抗菌活性，主要通过两倍梯度稀释法测出丁香精油对大肠杆菌O157:H7的MIC和MBC。经实验测得丁香精油对大肠杆菌O157:H7的MIC是0.5 mg/mL，MBC是1 mg/mL（图 2-1）。从实验结果可知丁香精油对大肠杆菌O157:H7显示了较强的杀菌性能。图2-1丁香精油对大肠杆菌O157:H7的MIC与MBCFig.2-1. MIC and MBC of clove oil against E. coli O157:H72.4.2丁香精油的MBIC和MBEC经实验测得丁

45、香精油对大肠杆菌O157:H7生物膜的MBIC是0.5 mg/mL，MBEC是1 mg/mL（图2-3）。从实验结果可知丁香精油对大肠杆菌O157:H7生物膜显示了较强的杀菌性能。从图2-3可以看出，0.5 mg/mL丁香精油对大肠杆菌O157:H7作用24 h后，大肠杆菌O157:H7生物膜细胞数量明显减少，杀菌效果明显。图2-2 丁香精油对大肠杆菌O157:H7生物膜的MBIC与MBECFig.2-2. MBIC and MBEC of clove oil against E. coli O157:H72.4.3丁香精油的杀菌曲线通过平板菌落计数法测定残存菌数观察丁香精油在0 h，0.5

46、h，1 h，2 h，4 h和8 h对大肠杆菌O157:H7的灭活作用，数据显示丁香精油对大肠杆菌具有良好的抗菌活性。分别使用浓度为0.5 mg/mL和1 mg/mL的丁香精油处理后大肠杆菌O157:H7的数量大约减少了1.2 Log CFU/cm2和5.1 Log CFU/cm2，随着时间的增加大肠杆菌O157:H7的数量减少的越多。实验结论为丁香精油处理后的大肠杆菌O157:H7的数量的对数与作用时间是呈线性减少关系。而对于没有加入精油的空白组而言，大肠杆菌O157:H7的量几乎不随时间的推移而变化。实验表明1 mg/mL丁香精油可有效杀灭大肠杆菌O157:H7。 图2-3丁香精油对游离的大

47、肠杆菌O157:H7作用后细菌数量随时间变化Fig.2-3. The number of remaining bacteria with the effect of clove essential oil on E. coli O157:H72.4.4 丁香精油在不同条件下对生物膜的清除结果2.4.4.1不同浓度条件下对生物膜的清除结果本实验将不同浓度条件下的丁香精油在同一处理时间（5 min）对大肠杆菌O157:H7生物膜进行处理，用平板菌落计数法和MTT染色法观察结果，如图2-4所示。大肠杆菌O157:H7完全附着于不锈钢表面的初始细胞数量约为107 CFU/cm2（图2-4 a），经1

48、mg/mL、2 mg/mL和4 mg/mL浓度的丁香精油处理5 min后，生物膜的数量显著减少（P < 0.001）。MTT法结果与菌落计数法具有很高的相似性。未加丁香精油的对照组（图2-4 b）的吸光度值高达1.50，而添加丁香精油的实验组吸光度值都有显著降低，吸光度值最低为0.27。结论为丁香精油能有效的清除大肠杆菌O157:H7在48孔板上形成的生物膜。 图 2-4 平板菌落计数法（a）和MTT染色法（b）测定不同浓度丁香精油同一作用时间作用于大肠杆菌O157:H7生物膜的杀菌效果Fig. 2-4. Effect of different concentrations of clo

49、ve oil on the viability of E. coli O157:H7 biofilms. The viability was determined by CFU counting method (a) and MTT staining method (b)2.4.4.2不同处理时间对生物膜的清除作用结果通过以上数据分析后发现1 mg/mL浓度的丁香精油对大肠杆菌O157:H7生物膜就具有显著杀菌效果，随后本实验选取了1 mg/mL浓度的丁香精油对大肠杆菌O157:H7生物膜进行不同时间的处理。分别采用平板菌落计数和MTT染色测定，如图2-5所示。与对照组相比，大肠杆菌O157:

50、H7初始细胞数量约为107 CFU/cm2，经丁香精油处理10 min 后（图2-5 a），大肠杆菌O157:H7细胞数量减少至约105 CFU/cm2。随着作用时间的增加，大肠杆菌O157:H7细胞数量显著减少（P < 0.001）。图2-5 b分析了MTT法测得的实验结果，具体如下，与对照组相比，最初大肠杆菌O157:H7初始吸度值高达1.50，经丁香精油处理5 min后实验组吸光度值显著降低（P < 0.001）。当处理10 min后实验组吸光度值有了进一步降低（P < 0.001），作用长达30 min后，吸光度值降为0.50左右。实验结果表明，浓度为1 mg/mL的

51、丁香精油能有效的清除大肠杆菌O157:H7在48孔板上形成的生物膜。图 2-5 平板菌落计数法（a）和MTT染色法（b）测定不同作用时间相同浓度丁香精油（1 mg/mL）作用于大肠杆菌O157:H7生物膜的杀菌效果Fig. 2-5. Effect of different treatment time of 1 mg/mL clove oil on the viability of E. coli O157:H7 biofilms. The viability was determined by CFU counting method (a) and MTT staining method (

52、b)2.4.4.3场发射扫描电子显微镜扫描本实验用场发射扫描电子显微镜直观地观察了丁香精油对大肠杆菌O157:H7生物膜的清除作用。由图2-6可以看出，空白对照组到生物膜表面的大肠杆菌O157:H7数量明显多于丁香精油作用后的实验组。空白对照组（图2-6 a）中可以看到大量的大肠杆菌O157:H7聚集成片，经过丁香精油作用后的实验组（图2-6 b），绝大部分大肠杆菌O157:H7生物膜从尼龙膜上脱落，仅剩少量细菌粘附在尼龙片的表面。实验结果表明，丁香精油对大肠杆菌O157:H7生物膜有较好的清除功能。图2-6丁香精油对大肠杆菌O157:H7生物膜作用前（a）与作用后（b）SEM图Fig. 2-

53、6. SEM images of E. coli O157:H7 before (a) and after (b) clove oil treatment2.4.5大肠杆菌O157:H7细胞形态变化从SEM图中可以明显看到大肠杆菌O157:H7在丁香精油作用前后的结构变化。如图2-7所示，未与精油作用的细菌细胞（图2-7 a）结构完整，看得出完整的形态。经过丁香精油作用后（图2-7 b），大肠杆菌O157:H7细菌形态发生了很大的改变，细菌细胞膜严重受损，有的甚至出现大面积溶解、破坏，已看不出具体的细胞结构。图2-7丁香精油对大肠杆菌O157:H7作用前（a）与作用后（b）的TEM图Fig.

54、2-7. TEM of E. coli O157 before (a) and after (b) clove oil treatment2.4.6大肠杆菌O157:H7胞内物质游离程度变化通过紫外分光光度法测定细菌上层清液在260 nm处的吸光度，测定结果表明与空白对照组相比，经丁香精油处理后大肠杆菌O157:H7细胞吸光度值明显变大（P < 0.001）（图2-8）。丁香精油的作用下，细菌结构被破坏，细胞膜通透性改变，胞内大分子物质不断地泄漏出来。这种泄漏现象也证明了丁香精油对细胞结构的破坏作用是不可逆的。 图2-8丁香精油处理前后大肠杆菌O157:H7在260nm处吸光度值Fig.

55、 2-8.The measurement of release of 260 nm absorbing materials before and after clove oil treatment2.4.7大肠杆菌O157:H7胞内DNA含量的变化本实验利用微量紫外分光光度计测定发现，经丁香精油处理后细菌的DNA含量由初始的8.5 g下降至1.3 g， DNA的总量下降了7.2 g，这意味着丁香精油使得细菌的核酸含量明显减少。此实验有效的证明了丁香精油会抑制大肠杆菌O157:H7 DNA的合成。图2-9丁香精油处理前后大肠杆菌O157:H7中DNA吸光度含量的变化Fig. 2-9. The s

56、bsorbance of DNA of E.coli O157:H7 treated with clove oil2.4.8大肠杆菌O157:H7胞内ATP含量的变化本实验通过利用ATP荧光检测仪测定作用前后ATP含量变化，由图可知（图2-10），经精油作用后，细菌胞内ATP荧光值由5700 RLU减少至900 RLU。胞内ATP的流失使得菌体的呼吸链严重受阻，加快细菌的死亡与裂解。图2-10丁香精油处理前后大肠杆菌O157:H7细胞内ATP含量变化Fig. 2-10. ATP bioluminescence intensity of E. coli before and after clov

57、e oil treatment2.5本章小结（1）丁香精油MBIC为0.5 mg/mL，MBEC为1 mg/mL。在清除大肠杆菌O157:H7生物膜时，随着丁香精油浓度与作用时间增加杀菌效果显著增强。（2）由扫描电镜分析，经丁香精油处理后大肠杆菌O157:H7生物膜松散脱落，丁香精油具有较好清除生物膜效果。（3）丁香精油会破坏细菌细胞膜的结构，从而改变细胞膜的通透性，导致胞内大分子物质， DNA、ATP泄漏，从而达到杀菌效果。第三章 冷等离子体杀菌性能及机制研究3.1引言冷等离子体是一个新兴的非热技术，是一种不仅安全而且能维护感官属性的方法。冷等离子体被定义为一种呈电中性的电离气体组成的混合物，冷等离子体主要是作用于细菌的细胞壁和细胞膜，使细菌生物膜细胞的通透性增加，内容物流出而导