两种大肠杆菌表达融合蛋白的纯化

1、两种大肠杆菌表达融合蛋白的纯化作者：王飙落陈南春陈苏民 【关键词】融合蛋白 关键词:融合蛋白;纯化 0引言 利用原核生物来表达外源蛋白是一种简便高效的获取重组产物的方法.但是，重组蛋白在大肠杆菌中往往形成不溶解的无活性的包涵体，仅有少量产物以溶解状态存在.我们通过两种不同的纯化方式，对如何获得有活性的蛋白表达产物进行初步的探讨. 1材料和方法 1.1材料融合表达质粒pJLcIIras和pGEX-4T-mcp分别由陈苏民教授和王字玲博士惠赠.大肠杆菌菌株TAP106和JM109及GST亲和层析柱，Sepharose4B层析柱和其他生化制剂均由本校生化教研室提供. 1.2方法将质粒pJLcIIra

2、s，pGEX-4T-mcp分别转化感受态TAP106，JM109，接种扩增后提取质粒行酶切鉴定.鉴定后菌种扩增至对数期，分别行37水浴和IPTG诱导表达，集菌并裂菌后120g・L-1SDS-PAGE分别鉴定菌体、裂菌后上清及沉淀中融合蛋白p21ras和GST-MCP-1表达情况1.诱导扩增后的菌液离心收集菌体，裂菌，TritonX100等去垢剂反复洗涤，最终离心后沉淀用8mol・L-1尿素溶液溶解.其中p21ras溶液分别针对4，2，1，0.5，0.25，0.1，Sepharose4B凝胶柱平衡液进行缓慢梯度透析，终溶液经Sephrose4B柱层析后测定产物的GTP

3、结合活性.GST-MCP-1则针对GST亲和层析柱平衡液透析，离心后行GST亲和柱层析，产物经48孔微型趋化装置测定其趋化活性2. 2结果 两种质粒经酶切鉴定符合构建条件.转化后的TAP106菌扩增及37诱导后，120g・L-1SDS-PAGE检测可见在约23ku处出现一条新生条带（图1）.紫外扫描测定约占菌体蛋白的15.6%.转化后的JM109菌IPTG诱导后可见于30ku处出现一新生条带（图2）.紫外扫描测定约占菌体总蛋白的31.6%.两新生条带分别符合融合蛋白p21cIIras和GST-MCP-1的分子大小.裂菌后的沉淀经TritonX100等溶液反复洗涤后，杂蛋白条带明显

4、减少.产物p21cIIras经梯度透析后过柱纯化，具备明确的GTP结合活性.而GST-MCP-1溶液经平衡透析后则直接行亲和层析，终产物有明确的单核细胞趋化活性. 图1略 图2略 3讨论 在原核生物尤其是大肠杆菌中表达外源基因产物时，所表达的真核生物蛋白的活性常难以保持.因原核生物的蛋白合成缺乏真核生物所具有的如糖基化等修饰过程，并且缺乏一些在肽链形成过程中必要的诱导分子，所以常常在胞质中形成难以溶解的无活性的包涵体3，4. 我们实验中所见两种融合蛋白均主要以包涵体形式存在，虽然为初步的纯化提供了有利条件，但却无法得到充足的具有生物活性的重组蛋白产物.考虑到包涵体的形成主要与肽链合成速率过快，

5、没有足够的时间和空间进行折叠和盘曲等空间构象的形成5，本实验采取了先用变性剂溶解包涵体，再通过缓慢的梯度透析逐渐除去变性剂，在这一过程中相当一部分肽链得以恢复其天然构象，成为可溶状态，经柱层析纯化后证实产物具有生物活性.本实验结果还表明，融合蛋白的表达方式不会对其生物学活性产生严重影响.设计合理的融合表达产物不但可使纯化过程简化，而且产物结构中酶切位点的存在也为进一步获取更高纯度和活性的重组蛋白创造了条件6. 参考文献: 1萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南M.北京:科学出版社，1992:20-35. 2陈苏民.大肠杆菌中高表达era重组蛋白的纯化及生化特性J.生物化学杂志，1992;1:33-41. 3KungHF.SolubilityofrecombinantproteinsexpressedinE.coliJ.CurrResProtChem，1990;3:467-476. 4GribskowM.Overexpressionandpurificationofthesigmasub-unitofE.coliRNApolymeraseJ.Gene，1993;26:109-118. 5陈苏民.era基因的高表达J.生物工程学报，1991;3:201-206. 6SmithDB，JohnsonKS.Single-stepputificationofpo