SELDI技术分析体外培养不同肝细胞株差异蛋白的表达

1、SELDI技术分析体外培养不同肝细胞株差异蛋白的表达 作者：丁守怡，钱冬萌，牟文凤，闫志勇，宋旭霞，王斌【关键词】 表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱；蛋白质陈列分析；肝肿瘤；肿瘤细胞,培养的；差异蛋白Analysis of different protein expressions in different liver cell strains in vitro using SELDI【Abstract】 AIM: To examine the differential expressions of proteins in hepatoma cell line (HepG2),hepat

2、oma cell line transfected by HBV （HepG2.2.15）compared with normal liver cell line(LO2) by using surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (SELDITOFMS), so as to establish a foundation for further studying on the mechanism of hepatoma at the protein level. METHODS: Th

3、e 3 types of cells above mentioned were cultured as general and collected when they were in good conditions. After cell disruption, SELDITOFMS was employed to detect the differential expressions of proteomes of HepG2, HepG 2.2.15 and LO2. RESULTS: Ninetyone proteins were captured by WCX2 array. Comp

4、ared with normal liver cell lines, in the segments from Mr 5000 to 15 000, proteins in the HepG2 and HepG2.2.15 showed apparent changes, in which 2 proteins expressions were increased in carcinoma cells, the other 5 decreased. Nine proteins in HepG2 were increased and 10 proteins in HepG 2.2.15 were

5、 increased. CONCLUSION: The SELDI ProteinChip technology can be a desired method in detecting the biological markers in the earlier period of hepatoma. This method is of convenience, high sensitivity, and good reproducibility. The biological tags of tissuespecific proteins we found have a potential

6、applying value in the early diagnosis of hepatoma. These tags are also meaningful in screening and identifying signal proteins from serum and tissue specimen in different types of hepatoma. Certain foundation has been established in studying the etiopathogenesis of hepatoma at the level of proteins,

7、 as well as the searching of new therapeutic target sites.【Keywords】 SELDITOFMS; protein array analysis; liver neoplasms; tumor cells, cultured; distinct protein【摘要】 目的： 运用表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱(SELDITOFMS) 技术,检测体外培养的肝癌细胞株（HepG2）,转染乙肝病毒的肝癌细胞株（HepG2.2.15）与正常肝细胞株（LO2）蛋白质的差异表达，筛选肝细胞癌的标志蛋白，为进一步研究肝癌发病的蛋白质组学

8、机制奠定基础. 方法： 常规培养上述3种细胞，细胞状态良好时收集细胞，裂解细胞后采用 SELDITOFMS技术用WCX2芯片检测HepG2, HepG2.2.15, LO2细胞内蛋白质组学的差异表达. 结果： WCX2芯片共捕获91个蛋白，在Mr 500015 000区段，与正常肝细胞株比较，有7个蛋白质在两种肝癌细胞中出现明显变化，其中2个蛋白在肝癌细胞中表达量增高，5个蛋白在肝癌细胞中表达量降低；另外两种肝癌细胞株也有其各自的标志蛋白，9个蛋白分子在HepG2表达量增高，10个蛋白分子在HepG2.2.15表达量增高. 结论： SELDI蛋白芯片技术检测可作为检测肝癌早期生物标记的方法，它

9、简便，敏感性高，重复性好，本文发现的这些组织特异性蛋白生物标记对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值，对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞之间的标志蛋白有重要意义，从而为从蛋白质水平研究肝癌的发病机制及新的治疗靶位的寻找奠定了一定的基础. 【关键词】 表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱；蛋白质陈列分析；肝肿瘤；肿瘤细胞，培养的；差异蛋白0引言原发性肝癌(HCC)在我国是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在部分城市中占恶性肿瘤死因的第二位. 每年有11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%. 肝癌早期没有明显体征，多数病人确诊时已属晚期，难以治愈，死亡率很高. 所以，对于肝癌的早期诊断

10、，在无症状的人群中发现早期病例，对控制肝癌的病死率有现实的意义. 因此，研究并寻找有价值的预警肝癌的标志物，成为进一步提高肝癌临床治疗水平的关键. 任何疾病在出现病理变化之前，细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应的改变，癌症的发生是一个多基因多阶段多因子的动力学过程，HCC也不例外，目前对肝癌发生机制的研究大都是在基因水平，但是mRNA的水平并不能真正代表所表达的蛋白质水平，因此，要求对生物功能的执行者蛋白质进行研究.蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织或一种生物体所表达的全部蛋白质1. 蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质组概念的延伸，是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律

11、的学科. 蛋白质组学技术为研究肿瘤标志物与肿瘤进展转移研究提供良好的技术平台, 为研究开辟了新的手段和视角. SELDI蛋白质芯片技术是近年来新兴的一种蛋白质组学技术，它具有简单、快捷、灵敏等特点，可以检测分子量在Mr 500500 000之间的蛋白或多肽，而且所需样本体积小（0.5400 L）2-3. 我们应用细胞裂解液裂解体外培养的3种细胞（LO2, HepG2, HepG2.2.15），进行了表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱技术（SELDITOFMS）分析，初步建立了正常肝细胞、肝癌细胞与转染乙肝病毒的肝癌细胞的蛋白表达图谱4，发现了一系列（信噪比）差异表达的蛋白，为今后从血清或肝

12、癌组织中筛选标志蛋白提供科学依据.1材料与方法1.1材料正常肝细胞株（LO2）购自中科院上海细胞库；肝癌细胞株（HepG2）及携带乙肝病毒的肝癌细胞株（HepG2.2.15）由第四军医大学吴力克主任医师赠送. HPLC水，乙晴，三氟乙酸，白芥子酸（SPA）,TritonX100，尿素，4羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），表面活性剂（CHAPS）均购自美国Sigma公司，蛋白质芯片时间质谱分析仪（PBSC）及WCX2（弱阳离子交换芯片）购自美国Ciphergen Biosystems公司.1.2方法1.2.1细胞总蛋白质的提取LO2, HepG2细胞采用含100 mL/L胎牛血清的1640培养基培

13、养，HepG2.2.15细胞另外加入终浓度200 g/L的G418,细胞长成单层后，用无菌细胞刮刀刮取细胞，PBS洗3次，加入裂解液（8 mol/L urea, 40 g/L CHAPS, 40 mmol/L TrisHCl， pH 7.4）200 L, 4剧烈震荡30 min, 20 817 g离心30 min. 上清采用日本日立的 Gene Spec V蛋白核酸分析系统测定蛋白浓度，用裂解液调节至所有样品浓度为2 g/L，其余上清分装-86备用. 每种细胞收获3次，以排除组间差别. 每份样品至少在2个以上的同种芯片上检测，以排除不同芯片间的差异.1.2.2WCX2蛋白芯片操作步骤将芯片装入

14、蛋白工作平台，每孔加入200 L结合/洗脱缓冲液（50 mmol/L NaAc, pH 4.0）预处理芯片，室温下200 r/min振荡5 min，弃缓冲液，重复上述操作1次. 每孔加入50 L 12稀释的样品，剧烈震荡，室温孵育1 h. 弃掉样品，每孔用200 L结合/洗涤缓冲液洗涤2次，每次震荡5 min. 弃去孔中液体，每孔加入200 L HPLC 水，立刻甩出. 从蛋白工作平台中取出芯片，空气中干燥，每孔加入0.5 L EAM（SPA中加入75 L乙氰和75 L 10 mL/L三氟乙酸）重复1次. 干燥后用蛋白质芯片阅读机进行质谱分析. 1.2.3数据采集和结果分析用加有Allinon

15、e标准分子量蛋白的NP20芯片校正质谱仪，仪器参数设置如下： 激光强度220，检测敏感度10，优化分子质量范围为Mr 200010 000,最高分子量为Mr 50 000,采用Ciphergen ProteinChip 3.0版本的分析软件自动采集数据，然后用Biomarker Wizard 软件分析LO2, HepG2, HepG2.2.15细胞的蛋白质谱差异.2结果2.1重复性试验为了保证试验结果的可靠性，我们首先进行细胞计数为1010/L，样品蛋白浓度为2 g/L以减少细胞本身蛋白的差异；同时每种细胞收获3次，以排除组间差别；每份样品至少在同种芯片3个以上不同点进行检测，以排除不同芯片点

16、之间的差异. 然后用SELDITOFMS对样品孔进行测定，经质谱分析后选择了8个蛋白峰，测变异系数，结果显示其M/Z及强度的CV分别为1%, 5%，分析结果表明试验重复性好，结果可靠. 2.2差异蛋白的比较2.2.1LO2, HepG2, HepG2.2.15三者比较明显差异蛋白峰共7个，其中Mr 7945, 7979在肝癌细胞中表达增高， 5818, 8428, 10 106, 10 312, 11 084在肝癌细胞中表达降低（图1）.2.2.2肝癌细胞和转染乙肝病毒的肝癌细胞蛋白质表达差异HepG2, HepG2.2.15细胞差异蛋白峰共19个， 9个蛋白峰在肝癌细胞中表达增高，10个蛋白

17、峰在肝癌细胞中表达降低（图2）.2.2.3差异蛋白质的初步鉴定将发现的差异蛋白峰在Swiss蛋白数据库中搜索（），发现Mr 11 084.0蛋白峰与钙结合蛋白S100 A10相符. 其他几种蛋白暂时寻找不到.A： LO2细胞；B： HepG2.2.15细胞；C： HepG2细胞. 上部分为蛋白峰表达情况: 横坐标表示相对分子量，纵坐标表示蛋白质峰的强度；Mr 11 084.6, 10 106.4蛋白在LO2中表达最高，在HepG2中次之，在HepG2.2.15中最低. 下部分为蛋白质图谱的模拟凝胶图： Mr 11 084.6, 10 106.4两条带是LO2, HepG2.2.15和HepG2

18、细胞的差异蛋白.图13种细胞在Mr 10 00011 500区段的蛋白质检测结果（略）A: Chip 19C G2; B: Chip 19H 2.2.15. 横坐标表示相对分子量，纵坐标表示蛋白质峰的强度. Mr 10 106.4, 11 084.0, 11 658.4蛋白在HepG2中高表达，在HepG2.2.15中低表达.图2HepG2, HepG2.2.15细胞在Mr 10 00012 000区段的蛋白质检测结果（略）3讨论肿瘤早期就可在蛋白质水平出现细微但重要的组合改变5，近来研究表明,肿瘤性疾病从蛋白质组学的角度又可以被认为是一种蛋白质缺陷病,其发生过程中有多种蛋白会发生异常变化.

19、从组织增生产生原位癌到产生癌变的过程中,有不同的功能性蛋白的参与；转移也是多步骤复杂连续的过程, 与转移有关的特殊基因受到激活并有多种水解酶的参与. 总之, 肿瘤在发生发展转移的过程中, 在分子水平有不同的功能性蛋白参与, 并且功能性蛋白很可能在各个环节相互协调共同表达. 蛋白表达异常不仅包括蛋白表达量的增加或减少,还包括蛋白翻译后加工上的改变,从而导致肿瘤组织表达的蛋白质谱(protein profile) 的改变. 因此利用蛋白质组学方法检测蛋白质谱的变化可以更加准确地诊断肿瘤及了解肿瘤的发病机制.临床上现有的HCC标志物众多，但尚无单一标志物能够诊断所有HCC. 这就需要探索一种新的技术

20、以发现早期肿瘤标志物. SELDI蛋白质芯片技术可检测疾病进展中不同阶段血清中多肽量的变化，翻译后修饰的改变或某些多肽的聚糖结构变化，为HCC肿瘤标志物的进展提供了一个新的方法，它灵敏度高、特异性好、重复性强、操作简单且微量化6，可同时检测血清中的多种蛋白质已被应用于检测多种生物学样品.体外培养的细胞株虽然不能完全反映体内细胞的生长状态和生物学活性，但它具有成分单一、均质性好、实验条件容易控制等优点. 尤其在做对比性研究时可避免由组织细胞成分复杂，细胞异质性高等缺点造成的结果不真实和不可靠7. 我们培养了LO2, HepG2和HepG2.2.15细胞，裂解细胞蛋白定量后SELDITOFMS分析

21、蛋白表达的差异. WCX2芯片，用于分析正电荷蛋白，弱阳离子碳化合物构成活性位点，与样品中赖、精或组氨酸反应，它捕获的蛋白pI一般大于4. 我们在分子量Mr 300030 000范围内，共捕获91个蛋白峰. 其中肝癌细胞株与正常肝细胞株差异蛋白共7个，不同亚型肝癌细胞与正常肝细胞比较有共同的差异蛋白，说明在肝癌的发生或发展过程中涉及到一些共同的蛋白质改变；我们对不同类型的肝癌细胞株差异蛋白质进行分析，结果HepG2, HepG2.2.15细胞差异蛋白峰共19个，表明不同肝癌细胞株也具有特异的差异蛋白，这对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞之间的标志蛋白有重要意义. 这些组织特异性

22、蛋白生物标记对我们从血清或组织标本中筛选或鉴定标志蛋白有重要意义，对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值，更主要的是为研究肝细胞癌变机制提供了一个基础，而且这些蛋白有可能为肝癌治疗提供新的靶位，可以进行RNA干扰来阻断其高表达或通过基因导入来促进低表达蛋白的表达.用Swiss蛋白数据库中检索分子量和pI值匹配的蛋白质发现Mr 11 084蛋白峰可能为钙结合蛋白S100 A10. S100蛋白家族是一个有21个成员的钙结合蛋白家族, S100蛋白通过对钙离子的调节及与靶蛋白的相互作用,在体内发挥多种生物学功能. 研究发现 S100家族与肿瘤的发生发展关系密切,它们参与细胞周期调控，在多种肿瘤中表达异常

23、,并与肿瘤的浸润、转移有关. S100 A10在肿瘤发生中的作用还不确定，它可能与Annexin II（p36）组成复合物，抑制p36磷酸化，参与细胞周期调控8. 在肝癌的发生中S100 A10可能通过p36起作用，它在肝癌细胞 HEPG2中低表达，抑制p36磷酸化的作用降低，从而抑制细胞增殖的作用降低，可能引起细胞生长失控而致癌.从理论上讲，肝癌在发生、发展过程中其细胞内的蛋白质变化可以反应到血清中，可从体外培养的肝癌细胞株中筛选出部分与癌病人血清相一致的标志蛋白，有些改变可能只存在于细胞内而不分泌或代谢到细胞外，这部分蛋白可能是与癌症的发病密切相关的功能蛋白和调节蛋白. 目前，我们正进一步

24、研究HBV感染携带者与HCC患者及正常人血清蛋白质的差异表达，结合体外培养细胞株的研究通过对比分析进一步筛选差异蛋白，下一步我们将蛋白纯化后进行序列测定，应用串联质谱分析鉴定特定的蛋白，以期确认肝癌的标志蛋白和功能蛋白，为临床肝癌的诊断提供新的思路，以期使肝癌的血清学诊断成为可能.【参考文献】1 Peng J, Gygi SP. Proteomics: The move to mixtures J. J Mass Spectrom, 2001,36(10):1083-1091.2 Robinson JC, Kerjan P, Mirande M. Macromolecular assembla

25、ge of aminoacyltRNA synthetases: Quatitative analysis of proteinprotein interaction and mechanism of complex assembly J. Mol Biol, 2000,304:983-994.3 Stoop AA,Jespers L, Lsters I, et al. High density mutagenesis by combined DNA shuffling and phage display to assign essential amino acid residues in proteinprotein inter