RAD51和BRCA1在结直肠癌中的表达及临床意义

1、RAD51和BRCA他结直肠癌中的表达及临床意义杨小丁 1程勇1汤为学2贾健锋1罗川栩1(400016重庆,重庆医科大学附属第一医院胃肠外科1,重庆市高校神经病学重点实验室2)摘要目的 观察结直肠癌中RAD5和BRCA1因的表达,探讨二者与结直肠癌 发生开展及治疗的关系.方法 收集结直肠癌癌灶及癌旁正常组织各42例,采用 逆转录-聚合酶链反响(RT-PCR及免疫组织化学法检测标本组织中 RAD51 BRCA1 mRNA蛋白的表达水平.分析RAD51 BRCA1结直肠癌中的表达水平与临床病理 特征的关系以及二者之间的相互关系.结果 RAD51、BRCA1癌组织中表达较癌旁正常组织高(P 0.05

2、);二者在月中瘤组织中蛋白和相应 mRNA表达成显著正相 关(RAD51 r=0.762 , p0.01 ; BRCA 1 r=0.696 , p0.01 ); BRCA1RAD5在结 直肠癌中的表达水平成明显正相关(蛋白：r=0.731 , p0.01 mRNA: r=0.572 , p0.01).结论BRCA1RAD5在结直肠癌组织中高表达,且二者的表达水平呈明 显正相关；BRCA1RAD5的表达异常可能与结直肠癌的发生开展有关.关键词结直肠癌；同源重组；RAD51 BRCA1Expression and clinical significance of RAD51and BRCA1 in

3、 colorectal cancerYang xiaoding 1, Cheng Yong1, Tang weixue 2, Jia Jianfeng 1, Luo chuanxu 1( department of Gastroenterological Surgery , First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University Chongqing 400016; 2Chongqing Key Laboratory of Neurology, Chongqing Colleges and Universities, Chongqing

4、 400016,China)Abstract Objective To investigate the expression of RAD51 and BRCA1 in colorectal cancer, and to explore their possibilities of occurrence、development and treatment with colorectal cancer.Method Expression of RAD51 and BRCA1 were detected in 42 cases of colorectal cancer and their adja

5、cent normal tissue .Specimens were detected by reverse transcription PCR (RT-PCR) and immunohistochemistry respectively. The relationship between RAD51 and BRCA1 expression level and its relation with the clinical and pathological features of colorectal cancer were analyzed.通信彳者 程勇, E-mail : chengyo

6、ngcqyahoo Result Immunohistochemistry showed that RAD51 and BRCA1 were both highly expressed in tumor tissue (P0.05) and the expression of RAD51 and BRCA1 in tumor tissue were significant positive correlation (protein： r=0.731 , p0.01 ； mRN A r=0.572 , p0.01) , and the expression of protein is corre

7、sponding with the result of RT-PCR (RAD51: r=0.762, p0.01; BRCA1 : r=0.696, p0. 05). Conclusion BRCA1 and RAD51 were highly expressed in colorectal cancer ,and their expression level was significant positive correlation. These results suggested the RAD51 and BRCA1 gene may play important roles in co

8、lorectal cancer occurrence and development.Key words Colorectal cancer; RAD51; BRCA1; Homologous recombination Corresponding author: Cheng Yong , E-mail: chengyongcq yahoo 结直肠癌是最常见的消化道恶性月中瘤之一,其发病率和死亡率均呈现上升趋 势,晚期治疗效果及预后极差.通过检测结直肠癌中某些特定基因、蛋白的表达水平,以期为有效防治结直肠癌提供理论支持.同源重组(homologous recombination, HR )是哺

9、乳动物细胞修复DNA双链断裂(doubles strandbreaks , DSBs)的一种重要方式,高度保真的 HR对维持基因组的稳定性起着至 关重要的作用.研究说明同源重组相关分子缺陷或者过表达与月中瘤的发生有关, 同源重组活性增强与月中瘤对放化疗的耐受增加有关1.RAD51白是HR的中央分子,在DNA损伤的修复过程中发挥着引导重组交换的关键作用20 BRCA1参与多 个DNA伤的修复通路,对DSBs的修复是其中之一 3.目前在多种月中瘤及细胞 中均发现RAD51 BRCA酌表达增高,且在局部月中瘤中其高表达与预后相关4, 5.但是,RAD5侪口 BRCA1E结直肠癌组织中的联合研究在国内

10、外鲜见.本研究以结 直肠癌为研究对象,检测 RAD5侪口 BRCA酌蛋白及mRNAfe达水平,分析其与病 理特征的关系,探索二者在结直肠癌发生、开展以及治疗过程中的作用.1材料与方法1. 1材料1.1.1 临床标本 选取2022年3 7月重庆医科大学附属第一医院胃肠外科手术 切除的结直肠癌灶及癌旁正常组织(距离癌边缘约10cm)各42例,其中男20例, 女性22例,年龄2483岁,平均61.43 12.91岁,结肠癌16例,直肠癌26例； 术前均未进行放疗和化疗；术后病理诊断证实高分化7例,中低分化35例；TNM分 期：I + II期18例,m + IV期24例；有局部淋巴结转移22例,无明显

11、转移 灶20例.标本取两份分别放入4肠聚甲醛和液氮中保存备用.1.1.2 主要试剂 免疫组化SP试剂盒北京康为世纪生物科技, 兔抗人RAD5第克隆抗体美国Epitomics公司,兔抗人BRCA多克隆抗体武 汉三鹰生物技术.RNAiso Puls总RNAl取试剂及RT-PC庄要相关试剂 PrimeScript RT-PCR Kit 和 Premi x Taq 大连宝生物工程. RAD51 BRCA和人B -actin引物由大连宝生物工程合成.RAD5W: gtggaattgagactggatctatca ,下游：gataaaggagctgggtctggt ,退火温度 55 c,扩增片段 长度为

12、273bp； BRCA1 上游：aagaaccaggagtggaaaggtc , 下游：ttcagggtcatca gagaagagg,退火温度56C ,扩增片段长度为263bp.人B-actin上游：gacccag atcatgtttgagacc ,下游：atctccttctgcatcctgtcg ,退火温度 55 C,扩增片段长 度为594bp0 1. 2方法1.2.1 RNA提取及RT-PCR检测 根据RNAiso Puls试剂盒说明书提取总 RNA逆专录RNA PCR扩增.逆转录条件：37C 5min , 85C 5sec ;以逆转 录的cDNM模板,PCR扩增各基因,反响条件为：94

13、 C预变性5 min, 94 C 30 s,退火温度30 s , 72 C 30 s ,进行30个循环,最后1次循环后72 C延 伸5 min.利用2.0%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪扫描成像,Quantity One软件分析各条带的吸光度值,以目的基因与内参B -actin吸光度的比值作为BRCA1 和RAD5仰因mRNA勺表达量.1. 2 . 2免疫组织化学 采用SP法检测RAD51,BRCAg白的表达.4%多聚 甲醛固定标本,石蜡包埋,4仙m厚切片,脱蜡,水化组织切片,0.1%枸檬酸盐 缓冲液抗原热修复,SP免疫组化染色,二甲苯透明中性树脂封固,显微镜下观 察.RAD51,BRCA1体1

14、： 150稀释,染色步骤按说明书进行,以PBS代替一抗 作为阴性对照.免疫组化结果判断以每个标本等距4小标 切片5张,光学显微镜下观察组 织切片,以出现黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为阳性.基于染色阳性数及着色强度评定免疫染色分级6.每张切片随机选择5个视野400x对染色细胞进行评分： 根据染色细胞数占计数细胞百分率,75%为4分；依据染色弓5度评予无染色0分,黄色1分,棕黄色2 分,棕褐色3分.两者的乘积为阳性等级.0分为阴性-,1-4分为弱阳性+, 5-8分以上为阳性+.9-12分以上为强阳性+.1. 3统计学分析 采用spss17.0统计软件,计数资料进行卡方检验,计量资料 采用Wilconx

15、on符号秩和检验和Kruskal-Wallis 秩和检验,相关性分析采用非参 数Spearman秩相关检验,以P 0. 05为差异有统计学意义.2结果2.1 RAD51和BRCA1组织中的表达结果RAD51在结直肠癌的胞核及局部胞质中表达,染色呈黄色或棕黄色颗粒,在正常组织中不表达或低表达；BRCA1细胞核和胞质中均见表达,在局部28.57% 正常组织中表达见图1.结直肠癌中RAD5和BRCA1mRNA：较正常组织高P 0.01见图2,表1,二者在月中瘤组织中蛋白和相应 mRNA表达成显著正相关RAD51 r=0.762 , p0.01 ; BRCA1 r=0.696 , p0.05; mRN

16、Ar=0.204 , p0.05);在结直肠癌组织中,RAD51 BRCA1 的表达成明显正相关(蛋白：r=0.731 , p0.01 mRNA:r=0.572 , p0.01 ).见表1.表1 RAD51和BRCA在结直肠癌和癌旁正常组织中的表达来源BRCA1(%)RAD51 ( %)-+ +mRNA-+mRNA正常组织24 (57.1%)18 (42.9%)0.10 0.2235 (83.3%)7 (16.7%)0.10 0.22癌组织12 (28.6%)30 (71.4%) a0.70 +0.96 b9 (21.4%)33 (78.6%) c0.51 0.26 d注：a,b , c, d

17、 同正常组织比拟p0.01 ; a、b相关性分析r=0.696 , p0.01 , c、d相关性 分析 r=0.762 , p0.01 ; a、c相关性分析(r=0.731 , p0.01 ) ; b、d相关性分析(r=0.572 , p 0. 05)表2 RAD51、BRCA蛋白和mRNA结直肠癌中的表达及其与临床病理特征的关系临床病理参数例数RAD51( 阳性%P直rad51mRNAP值BRCA阳性1(%P直BRCA1mRNAT男女年龄(岁)192314 (73.7)19 (82.6)0.4830.46 0.270.57 0.250.90413(68.4)18(78.3)0.4700.66

18、 0.930.73 1.001.00060淋巴结182414 (77.8)19(79.1)0.1940.49 0.250.53 0.280.84513(72.2)18(75.0)0.8390.73 1.130.67 0820.984有无分化程度222015(68.1)18(90.0)0.0880.44 0.280.59 0.270.06213(59)16(80)0.1430.85 1.290.53 0.300.852高 中低 分期7356(85.7)27(77.1)0.6140.66 0.140.48 0.270.0626(85.7)24(68.6)0.3590.52 0.180.57 0.7

19、10.063I + 口 m+iv182416(88.9)17(74.5)0.1580.58 0.230.46 0.280.14514(77.8)16(66.7)0.4300.51 0.0310.84 1.230.5863讨论同源重组功能的正常对维持细胞遗传的稳定和正常的生命功能具有重要作 用,而当同源重组功能过度活泼那么会引起不适当的基因重组,从而引起基因的不稳定,研究认为这种基因的不稳定可能是月中瘤发生、开展的重要原因之一.RAD5是大肠杆菌RecA蛋白的同系物,具有DN欷赖性ATP敷酶活性,在DNA损伤 后的修复过程中发挥着引导重组交换的关键作用7.人乳腺癌易感基因1(breast can

20、cer susceptibility gene 1, BRCA1)参与HR周复DSBS勺过程主要在早期发挥作用,BRCA1于RAD51蛋白聚集到DSB垃点,使RAD51磷酸化,其作用相当于损 伤检测分子网,感应DN颇伤,并将信号传递给下游的修复效应器30 BRCA1同 源重组的必需成分RAD5共同位于有丝分裂细胞核聚集点(nuclear foci )是BRCA参DN颂伤的证据网.BRCA1RAD5参与DN颂伤的修过程可概括为：DN颂 伤后,BRC刖口其他分子构成的复合体感受DN颇伤反响,并将此信号传递给下游 基因,RAD5接受DSBs言号,并启动HRtDSB进行修复.本研究通过检测结直肠癌中R

21、AD5和BRCA的表达水平,发现两者的表达均 较正常结直肠组织升高,与性别、年龄、分化程度、TNM分期等均无统计学差异, 且二者的表达成明显的正相关,说明二者构成的信号通路在结直肠癌中的活性是 增加的,我们推测以RAD5为中央分子的HR1路的活性增加可能与结直肠癌的发 生开展有关.很多传统的抗月中瘤药物包括烷化剂、DNA交联剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢药物等都是通过直接或间接造成不同形形式的DNA伤来实现抗月中瘤作用.其中DSB加最严重的致死性损伤,月中瘤细胞中同源重组基因表达增加,导致同 源重组对DSBs的修复水平增强,造成肿瘤细胞对化疗药物的反抗.多个研究发 现降低HR相关分子的表达水平,

22、可增加月中瘤细胞对化疗药物的敏感性.Ito等以RAD5伪靶点,在多个月中瘤细胞系中利用siRNA下调RAD5酌表达,月中瘤细胞 对顺柏的敏感性增高10;类似的,Tsai等在非小细胞肺癌转染RAD51siRNA&, 癌细胞RAD51表达下调,月中瘤细胞对吉西他滨的敏感性明显增加11.同样,在BRCA缺陷月中瘤细胞中,月中瘤细胞对交联剂的敏感性增加；而高表达BRCA酌月中瘤细胞对化疗药物的耐受性增加1;另外,BRCA假失的细月fi显示出RAD51介导 的染色体DSBs同源重组修复缺陷12.这些研究结果提示 BRCA1 RAD51参与的HR对DNA损伤修复在化疗耐受中起重要作用.本研究发现在结直肠癌

23、中BRCA1和RAD51的表达水平均较正常组织高,且两者表达水平呈明显相关性.我们推测 在结直肠癌中,BRCAW RAD51高表达引起HR活性增加,从而对化疗药物造成 的DSBs的修复水平增强,引起肿瘤细胞耐药,这可能是目前临床化疗效果令人 满不意的原因之一.但是,二者高表达对月中瘤化疗耐药性的更多更确切的机制还 需要进一步的研究.综合文献及本次研究结果,我们推测 BRCA1 RAD5参与的HRS路可能与结 直肠癌的发生、开展及治疗密切相关.尽管目前对于BRCA1,RAD51及HR多复通 路在月中瘤发生及治疗中所起的作用已经有大量的研究,但很多确切机制仍不清 楚.进一步明确BRCA1 RAD5

24、以及HR窗复三者之间参与月中瘤发生开展的机制以 及如何调节BRCA 1 RAD5的表达水平以适应月中瘤治疗的需要,将成为值得进一 步深入研究的问题.参考文献1 Helleday T. Homologous recombination in cancer development, treatment and development of drug resistanceJ. Carcinogenesis, 2022, 31(6): 955-960.2乔贵宾.Rad51在同源重组中作用及其与肿瘤关系的研究进展J.中华肿瘤防治杂志,2022(4): 306-310.3 Zhang J, Powell

25、S N. The role of the BRCA1 tumor suppressor in DNA double-strand break repairJ. Mol Cancer Res, 2022, 3(10): 531-539.4 Qiao G B, Wu Y L, Yang X N, et al. High-level expression of Rad51 is an independent prognostic marker of survival in non-small-cell lung cancer patientsJ. Br J Cancer, 2022, 93(1): 137-143.5 Soderlund K, Skoog L, Fornander T, et al. The BRCA1/BRCA2/Rad51 complex is a prognostic and predictive factor in early breast cancerJ. Radiother Oncol, 2022, 84(3):242-251.6陈志功,王树凯,周辉,等.CD44s和整合素3 1在人脑胶质瘤中的表达及其临床意义J.第三军医大学学报,2022(12): 1312-1313.7 Sung P, Krejci L, Van Komen S