紫菜转录基因组学的研究进展

1、紫菜转录基因组学的研究进展1. 前言紫菜在分类学上隶属于原红藻纲(Protoflorideophyceae)或称红毛菜纲(Bangiophyceae)，红毛菜目(Bangiales)，红毛菜科(Bangiaceae)。目前，已经确认的物种有117个()，常见种类包括坛紫菜(Pyropia haitanensis)和条斑紫菜(Pyropia yezoensis)等(Sahoo et al., 2002; Blouin et al., 2011; Sutherland et al., 2011)。紫菜是一种非常重要的大型经济海藻，全世界紫菜的年净产值约

2、13亿美元（表1）。现代分析技术研究显示，P. yezoensis蛋白质、紫菜多糖含量丰富，而脂肪含量相对很少，其中蛋白质含量高达干重的36%，是一种典型的低脂类营养保健食品(高淑清和单保恩, 2004; 童冠文, 2010)。同时紫菜中丰富的多糖经现代医学药理分析表明，具有降血糖、降血脂、抗病毒、调节免疫、消炎和抗衰老等多种药物功能(周慧萍和陈琼华, 1990; Yasuko et al., 1993; 肖美添等, 2003; 王长云和管华诗, 2000)。在我国两个主要的栽培品种是P. haitanensis和P. yezoensis，其中P. haitanensis为我国特有种，P. y

3、ezoensis每年的产量近7,000 t干重，而P. haitanensis则达到55,000 t，仅这两种紫菜每年的净产值就达2.6亿美元。P. yezoensis是日本和韩国的主要栽培品种，其年净产值分别达到8.4亿和 2.1亿美元。表1 紫菜年产量统计表(引自 Blouin et al., 2011)国家种类总产量（吨（干重）/年）总产值（国家）20002002200420062008日本P. yezoensis29,03632,05925,62029,83225,8858.41亿美元韩国P. yezoensis13,04821,00022,85521,75622,4242.09亿美元

4、中国P. yezoensis3,5705,2245,4875,8686,9392.58亿美元P. haitanensis38,33452,41364,91970,87155,071总计83,988110,696118,811128,327110,31913.07亿美元紫菜的生活史由两个世代，即孢子体世代和配子体世代组成，属于异形世代交替，以P. yezoensis为例，其生活史如图1所示。紫菜基因组相对较小（如P. yezoensis仅有3条染色体，约2.6×108bp），种系发生时间短（1-3 个月），在实验室对生长发育进行可控调节，相对比较容易获得纯系，且紫菜原生质体的制备技术已

5、经基本成熟(Sahoo et al., 2002; 汤晓荣等, 2006)；同时，由于作为潮间带藻类的紫菜，其生存环境中经受盐度、温度和辐射等环境因子的剧烈变化，使其具有较高的生物学抗逆特征；又因为紫菜具有重要的经济价值，使其成为分子生物学，遗传学和基因组学研究的理想模式物种(Sahoo et al., 2002)。图1 条斑紫菜生活史简图（引自 Sahoo et al., 2002）随着后基因组学时代的来临，相继出现了以转录组学、蛋白质组学、代谢组学等为代表的各种组学技术, 其中转录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术(Lockhart and Winzeler, 2000)。过去十几年中

6、，转录组领域关于藻类的研究工作主要是利用微阵列(Microarray)、表达序列标签(Express sequence tags, ESTs)等技术来寻找藻类新基因或进行基因表达水平研究，这些研究中多以藻类在胁迫条件下的基因表达为主。同时，随着最新一代测序平台的发展以及市场化运作，以微卫星(Simple sequence repeats, SSR)技术为代表的新一代测序技术被应用到藻类研究中来。本文重点针对紫菜的转录组学研究进展进行综述，以了解目前紫菜作为模式生物，在转录基因组学方面取得的重要研究成果(Kitade et al., 2008)。2. 紫菜的表达序列标签(EST)研究藻类的表达序

7、列标签(EST)研究工作一直是热点，也获得了较丰富的研究成果。其中对于紫菜的研究工作开展也较多，多数工作集中于紫菜cDNA 文库构建及获得了大量的EST 信息(Niwa and Aruga, 2003, 2006; Niwa et al., 2005,2008)，以下选取近年来典型的紫菜EST研究作介绍。为了揭示紫菜生活史的分子调节机制，Asamizu等人构建了P. yezoensis孢子体EST文库，获得了10,625条EST序列，并将获得的孢子体 EST 与之前Nikaido I 等人获得的10,154条配子体EST数据放在一起分析，以鉴定紫菜两个世代中的不同表达基因(Nikado et

8、al., 2000; Asamizu et al., 2003)。Fan等人(2007)从P. haitanensis孢子体中获得了EST序列5318条，经聚类发现形成非冗余序列2535条，其中仅有32.2%序列（816条）与公共数据库(Nr和KOG数据库)中的序列具有相似性；从功能分类上显示，绝大多数EST都与其保守生物代谢过程相关，并且首次在P. haitanensis中发现可能存在抗氰呼吸(Cyanide-resistant respiration)及C4途径固碳方式（图2），此外还发现多种与细胞信号转导相关的蛋白及蛋白家族基因，如HSP70家族。密码子分析表明，P. haitanens

9、is在进化过程中可能也经受过高GC片段的压力影响。图2 推测P. haitanensis的C4途径固碳方式带有数字标记的框代表确定的基因：EC 1：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC); EC ：天门冬氨酸氨基转移酶(AST); EC 9：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)3. 微阵列技术在紫菜转录组学研究中的应用微阵列(Microarray)技术是开发最早也是目前应用较广的高通量转录组检测技术，但是由于微阵列技术基于杂交技术，因此仅限用于对已知序列进行测定，而无法对新的RNA进行检测 (Tautz, 1989; Litt and Luty 1989;

10、祁云霞等, 2011)。以往由于藻类序列信息相对缺乏，使得微阵列技术在藻类中的广泛应用进度不大，然而近年来，随着越来越多的藻类物种基因组测序完成，同时，也受益于表达序列(EST)信息的丰富性，使得该技术在藻类领域的应用取得了较好的拓展(Wattier, 2000)。由于P. yezoensis的EST 信息相对来说比较丰富，周晓君等(2006)选择467个包含P. yezoensis功能基因的基因克隆制备cDNA 微阵列，并将cDNA 微阵列技术首次应用于紫菜中，以研究P. yezoensis不同世代的基因表达差异性。分析结果显示，配子体中的55个基因表达量上调，其中与已知或推测功能基因相匹配

11、的有21个；孢子体中有86个基因表达量上调，其中24个与已知功能基因相匹配。从而证明经过优化的cDNA微阵列制备技术用于P. yezoensis基因表达分析具有高效性和实用性。4. 微卫星技术在紫菜转录组学研究中的应用微卫星（Microsatellite DNA），又称为简单重复序列(Simple sequence repeats, SSR)，是由 2-6 个碱基排列构成的基序，通过重复串联起来形成的 DNA 序列，由于重复次数的不同，能够形成多个不同的等位基因位点(Liu and Luty, 1989; Tautz, 1989; Hu et al., 2007, 2010)。由于重复序列的侧

12、翼序列的相对保守性，我们就可以通过侧翼序列进行引物设计，采用PCR对目的位点进行特异性扩增，并将扩增出的片段根据长度的不同用于分子标记的开发(张增翠和侯喜林, 2004; 刘必谦等, 2005)。由于 SSR位点在基因组中含量丰富且分布均匀，利用SSR作为分子标记物对生物样品进行调查时，能够真实准确的反映出生物遗传多样性(田之海, 2013)。SSR位点在真核生物基因组中分布均匀，大豆、水稻和玉米的 EST 数据中SSR位点数为13个/10 kb，而在白杨和棉花EST数据中SSR位点数为1个/1420 kb；关于P. yezoensis转录组重复序列的报道中SSR位点数为1个/11.6 kb，

13、SSR位点丰富度适中(Yang et al., 2011)。同时，分子标记技术在紫菜中的研究也得以广泛开展。Kong等(2009)人利用SSR标记技术研究了11个来自于不同点位的P. yezoensis品系遗传多样性；同时，有学者利用SSR分子标记技术研究P. haitanensis的减数分裂，研究认为壳孢子萌发形成的两个细胞再次分裂时进行减数分裂(Yan and Huang, 2010)。Xie等人（2010）利用 SSR和SRAP (sequence-related amplified polymorphism)技术构建了覆盖度为88.1%的P. haitanensis遗传连锁图谱，为紫菜

14、的高密度遗传连锁图谱构建奠定了良好的基础。姚继承(2004)利用从Gene Bank数据库中获得到的3个SSR位点，以及利用小片文库筛选出来的2个SSR，对2种P. yezoensis和7种P. haitanensis（7个紫菜品系）进行遗传分析。其中，P. haitanensis在不同海区、不同品系与野生样品间存在较大的遗传差异性；而两种P. yezoensis品系间的遗传相似系数达到90.3%，P. yezoensis和P. yezoensis间的遗传相似系数在35.5%-64.5%之间。刘必谦(2005)从P. yezoensis的EST中找到了211个SSR位点，并从这些SSR位点获得

15、了15对引物，成功将其中的13对引物用于P. yezoensis SSR的扩增中，上述结论显示两个紫菜种间SSR具有较高的同源性。Sun(2006)也在 EST 数据库中获得了391 个SSR位点，发现了41对能有效扩增出条带的引物，并且将这些引物用于多个紫菜品系的遗传多样性分析，并构建了紫菜品系的系统进化树。于一(2010)利用富集文库法构建了P. yezoensis和P. yezoensis富含(GA)和(CA)的基因组文库，并采用PCR检测和原位杂交技术，筛选出了62个含有SSR的阳性克隆。杨惠(2011)首次利用富集筛库法从P. yezoensis中获得 24个SSR位点，并利用其中的

16、12对具有多态性的SSR位点对青岛的野生P. yezoensis进行遗传评估，得到了29个等位基因；随后利用全部的24个SSR位点分析了11株来自不同地域的P. yezoensis丝状体，其中11个P. yezoensis的遗传距离是0.05-0.35，聚类结果明显将11个个体分为了两支。5. 结语转录组学研究的首要前提是获得大量的序列数据，尽管目前其他藻类的序列信息片段化仍十分严重，许多群体在分子水平上还知之甚少，但紫菜作为分子生物学与基因组学中的模式生物，已经在转录组学的研究中取得了重多成果。由于紫菜种类的多样化以及在遗传变异上所具有的特异性，针对紫菜的研究工作仍旧艰巨，但伴随着新一代测序

17、技术的兴起，研究手段的多样化，一定能够促进紫菜的转录组学的研究工作。同时，高通量测序技术的深度发展，使得研究获得的信息量也正以几何级数增长，如何处理庞大数据量所带来的信息学难题，更好地诠释、比对和鉴定多个类似的同源基因，确定最佳测序量、获得高质量的转录图谱等难题有待进一步研究。随着紫菜产业的蓬勃发展，以转录组学为代表的生物技术在其中的应用将更为广泛，这些研究不但是对紫菜生物学的研究需要，同时也是紫菜生物产业化中必须解决的上游技术问题，在未来这些研究工作必将为人类解决食品安全问题提供坚实保障。Asamizu E, Nakajima M, Kitade Y, Saga N, Nakamura Y,

18、 Tabata S. Comparison of RNA expression profiles between the two generations of Porphyra yezoensis (Rhodophyta), based on expressed sequence tag frequency analysis. J Phycol, 2003, 39: 923930 Blouin NA, Brodie JA, Grossman AC, Xu P and Brawley H. Porphyra: a marine crop shaped by stress. Trends in P

19、lant Science, 2011, 16(1): 2937Fan XL, Fang YJ, Hu SN, Wang GC. Generation and analysis of 5318 expressed sequence tags from the filamentous sporophyte of Porphyra haitanensis (Rhodophyta). J Phycol, 2007, 43(6): 12871294.Hu Z. M., Liu F. L., Shao Z. R., et al. NrDNA internal transcribed spacer reve

20、aled molecular diversity in strains of red seaweed Porphyra yezoensis and genetic insights for commercial breeding. Genetic Resources and Crop Evolution, 2010, 57: 791799 Hu Z., He Y., Xia P., et al. Molecular identification of Chinese cultivated Porphyra (Bangiaceae, Rhodophyta) based on the rDNA i

21、nternal transcribed spacer-1 sequence and random amplified polymorphic DNA markers. Marine Biology Research, 2007, 3: 2028Kitade Y., Yamazaki S., and Saga N. A method for extracton of high molecular weight DNA from the macroalga Porphyra yezoensis(Rhodophyta). Journal of Phycology, 2008, 32(3): 4964

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24、 Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature, 2000, 405(6788): 827836.Nikado I, Asamizu E, Nakajima M, Nakamura Y. Generation of 10,154 expressed sequence tags from a leafy gametophyte of a marine red alga, Porphyra yezoensis. DNA Research, 2000, 7: 223227 Niwa K., and Aruga Y. Identification o

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26、35 Niwa K., Kato A., Kobiyama A., et al. Comparative study of wild and cultivated Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta) based on molecular and morphological data. Journal of Applied Phycology, 2008, 20: 261270 Niwa K., Kikuchi N., and Aruga Y. Morphological and molecular analysis of the endange

27、red species Porphyra tenera (Bangiales,Rhodophyta). Journal of Phycology, 2005, 41: 294304 Sahoo D, Tang XR, Yarish C. Porphyra-the economic seaweed as a new experimental system. Current science, 2002, 83: 13131316 Sun J. W., Guo B. T., Jin D. M., et al. Development of SSR primers from EST sequences

28、 and their application in germplasm identification of Porphyra lines(Rhodophyta). European Journal of Phycology, 2006, 41: 329336 Sutherland J, Lindstrom SC, et al. A new look at an ancient order: generic revision of the bangiales (rhodophyta). J Phycol, 2011, 47: 11311151Tautz D. Hypervariabflity o

29、f simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research, 1989, 17: 64636471 Tautz D. Hypervariabflity of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research, 1989, 17: 64636471 Wattier R. A., Prodöhl P. A., and Maggs C. A.

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31、markers. J Phycol, 2010, 46: 780787Yan XH, Huang M. Identification of Porphyra haitanensis (Bangiales, Rhodophyta) meiosis by simple sequence repeat markers. Journal of Phycology, 2010, 46: 982986 Yang H, Mao YX, Kong FN, Yang GP, Ma F, Wang L. Profiling of the transcriptome of Porphyra yezoensis with Solexa sequencing technology. Chinese Sci Bull, 2011, 56(20)