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文档简介

1、标准曲线制作考马斯亮蓝法测 蛋白质含量标准曲线制作一考马斯亮蓝法测蛋白质含量1、 标准曲线一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线 查出所测物质的含量。因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。2、 蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩月尿法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法3、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝 G 250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85%H3P04,雍蒸储水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01% (W/V)考马斯亮蓝 G250,4

2、.7% (W/V)乙醇,8.5% ( W/V ) H 3P。4。2、标准蛋白质溶液:纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理()。2、移液管使用()。(三)、标准曲线制作:1、试管编号0123456100ug/ml标准蛋白(ml)0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/L NaCl (ml)10.90.80.70.60.50.4考马斯凫然试剂(ml)5555555摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A 595nm2、以A595nm为

3、纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ugx 50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。1)、利用标准曲线查出回归方程。2)、用公式计算回归方程。3)、或用origin作图,测出回归线性方程。即A595nm=aXX()+6一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上。4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。(四)、蛋白质含量的测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1 操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的A595nm值在01一005之间,所

4、以上述样品如果A595nm值太 大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。2、取量要准确。3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。4、对照:用被测物质以外的物质作空白对照。药品的配制(磷酸缓冲液的配制)一、药品的配制步骤(一)、实验准备:1、 准备所需的药品和玻璃仪器。2、 洗涤。(怎样洗涤算干净?)(二)、计算:1、百分比浓度计算:1)、G/V 比例如配1% NaCl ,称1g NaCl溶于100ml水。2)、V/V 比:例如配 75% 乙醇 100ml ,75% 乂 100%=100% XX, X=75ml。取 75ml 无水乙醇, 加25ml蒸储水

5、。乙醇:乙醴:丙酮=2: 1: 2配500ml,各取200 ml, 100 ml, 200 ml混合。3) G/V比:用的较少,如计算灰分中某种元素如Fe的含量。2、摩尔浓度计算:注:药品的分子量一般在标签中注明。1)、0.1M 或 0.1mol/L NaCl 配 100ml。M=质量/体积(L)称取NaCl0.1 X0.1X40=0.4g 摩尔数=G ( g) /摩尔质量2)、0.1mMNaCl 配 100mlmM=毫摩尔数 /体积(L)称取 NaCl0.1 X 0.1 x 40=0.4g毫摩尔数=G (mg) /摩尔质量3)、0.1uNaCl 配 100mlmM=微摩尔数 /体积(L)称取

6、 NaCl0.1 X 0.1 x 40=0.4mg微摩尔数=G (ug) /摩尔质量称取NaCl0.1 x 0.1X 40=0.4ug3、 混合溶液配制的计算:如配 3uMEDTA , 2.25mM NBT 以及 60uM溶液 100ml,用 50mM 磷酸缓冲液配制。注意:1、分别标定体积计算2、分别配制再混合,但总体积不能为100ml(三)、标量:1、根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器,如量筒或移液管。2、电子分析天平的使用。(四)、溶解:1、根据药品配置要求选择溶剂。蒸储水,双蒸水,无离子水等。2、只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右,剩余溶剂洗涤烧杯

7、三次左右,直到洗涤干净。小常识:药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式,可根据分子式 和所学的常识判断药品的结构和性质特点(包括溶解性质)。如酸碱两性物质的配制(AA、蛋白质、核甘酸等)如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解,但 pH应在被要求的范围内。3、加热促进溶解,但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。如配0.1%的淀粉,水裕加热(温度在 80-90 C),过量会糊化。(五)、定容:1、用容量瓶定容;2、用玻璃棒引流或用小漏斗;3、用溶剂加入到接近刻度,然后用滴管加入到刻度。要求刻度与液体凹面相切 为止(眼睛可视);4、上下窑洞容量瓶几次,混合均匀即可。(注意不再定容了,

8、防止溶液漏掉。(六)、装入试剂瓶,贴上标签。标签应注明以下内容:药品浓度、名称、配制人、配制日期等。(七)、清理实验场所。二、磷酸缓冲液的配制。(一)、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液。用磷酸氢二钠一磷酸二氢 钠做缓冲液。选用药品:Na2HPO4 - 12H2O (碱)和 NaH2PO4 - 12H2O (酸)配缓冲液 100mle 书中说明。(二)、计算:1、注:书中有注明配置的量。2、计算:Na2HPO4 - 12H2O 称取 71.64X 0.1=7.164gNaH2PO4 12H2O 称取 31.21 x 0.1=3.121g3、含有不同结晶水的换算。书中配1/15mol/L的缓冲液配1L,书中用Na2HPO4 2H2O需要11.87g/L但用 Na2HPO4 12H2O 需多少 g?11.87= (178/358) XX, X=23.87g。(三)、分别配制缓冲液各100ml (根据需要确定配制的量)。即:0.2M Na2HPO4 - 2H2O 和 NaH2PO4 2H20100ml。(四)、按书中的量配制取量再混合。如:pH=6.8,分别去缓冲对 49ml和51ml。(五)、用pH试纸

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