大肠杆菌的培养

1、大肠杆菌种子液的制备牛肉膏蛋白月东培养基的配方：液体培养基 牛肉膏 3.0g蛋白月东10.0g氯化钠 5.0g水 1000mlpH 7.4-7.6固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5 % 2.0 %的琼脂1 试管斜面与平板的制备 称量 按培养基配方比例依次准确称取蛋白月东、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。 熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅 匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后， 补充水到所需的总体积。将称量好的1.8 %琼脂放入已溶的药品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。(3) 调PH在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH,如果偏酸，用滴

2、管向培养基中逐滴加入 1mol/L NaOH, 边加边搅拌，并随时用PH试纸测基 PH直到PH达到7.4-7.6 。反之用1mol/L HCl进行调节。 分装 将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。具试管 装量不超过管高的1/5 ,三角烧瓶的量不超过1/2加塞 培1 / 10下载文档可编辑 养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。 包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层 牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名 称、配制日期。 灭菌 将上述培养基以 0.1Mpa,121c ,15min高压蒸气灭 菌。 倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三 角烧瓶中的

3、培养基倒制三个平板培养基，冷却。(8)搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷却至 50c左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的 一半为宜。2 接种大肠杆菌斜面种子(1) 取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近，用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。(2) 将接种好的斜面放入37c的恒温培养箱子中培养24h。3 制备平板种子(1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度稀 释为1倍，10倍，100倍和1000倍，用移液枪分别吸取 各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次吸 取溶液100ul),然后在3

4、7 c培养箱中过夜。(12) 次日，挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新2 / 10下载文档可编辑鲜灭菌的牛肉膏蛋白月东液体培养基中 37C, 170r/min恒 温振荡培养18h作种子培养液。其后的实验中，每次实验前从种子培养液中吸取 2ml菌液接种于新鲜 灭菌的液体培养基中，37C, 170r/min恒温振荡培养使用牛肉膏蛋白月东培养基组成成分：牛肉膏3g,蛋白月东10g,Nacl 5g,琼脂1520g,水1000mL,PH7.47.6。具体配置步骤：1 .称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛 肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可 放

5、在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取 出纸片.蛋白月东极易吸潮，故称量时要迅速.2 .加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小 火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量.若配 制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此 过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分.3 .调pH检测培养基的pH,若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH,边加边 搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围.若偏碱，则用 lmol/L HCl进行调节.pH的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不 要调过头，以免回调而

6、影响培养基内各离子的浓度.4 .过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过 滤，以利培养的观察.但是供一般使用的培养基，这步可省略.3 / 10下载文档可编辑5,分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装 时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染.分装量：固体培养基约为试管高度的1/5,灭菌后制成斜面,分装入三 角瓶内以不超过其容积的一半为宜,半固体培养基以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝.6,加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞. 棉塞的形状，大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起 到防止杂菌侵入和有利通气的

7、作用,要使棉塞总长约3/5塞入试管口 或瓶口内，以防棉塞脱落,有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱 布制成通气塞,有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞.7 .包扎 加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸 ，以防灭 菌时冷凝水沾湿棉塞,若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一 起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好,然后用记号笔注明，培养基 名称，组别，日期.8 .灭菌 将上述培养基于121.3 C湿热灭菌20min,如因特殊情况不能 及时灭菌，则应故入冰箱内暂存.9 .无菌检查 将灭菌的培养基放入 37c温箱中培养2448h,无菌生 长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用.大肠杆菌的

8、培养：37摄氏度，恒温培养48到72小时，因为接种时和具体培养条件的 不同，其生长一般都在2天外才能长出明显的菌落。4 / 10下载文档可编辑菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜 色一致。大肠杆菌/大肠菌群显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养 基，用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的 快速检测。大肠杆菌显蓝色至紫色，大肠菌群显红色。成份(g/L)特殊营养物质28.19混合显色剂0.31琼脂13.0pH 6.8 士 0.2 25 C此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。5 / 10下载文档可编辑注息此培养基仅供实验室使用。用法称取本品41

9、.5g加入1000ml蒸储水，加热溶解并不停搅拌，煮沸不要超过1分钟。取1ml制备好的样品液加入直径为 9cm无菌平 皿中心，倾入冷却至45-50 C培养基约15ml ,混匀，凝固后，再 加入一层培养基进行履盖。或冷却至 45-50 C时，倾入无菌平皿， 琼脂完全凝固后，在37 C的培养箱中倒置放置1-2小时，力口入适 当稀释度的样品液1ml ,涂布于培养基上，36 土 1 C培养1824h。贮存制备好的平板应立即使用，应避免光线直接照射。干燥培养基应放置 于阴暗干燥处， 保存温度2-8 C,注意避光保存。失效干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。6 / 10下载文档可编辑操作步骤1

10、、按国家标准、SN标准、FDA标准或其它方法制备样品液2、取样品液1ml加入 冷却至45-50 C显色培养基中混匀或 涂布于平板上3、36 士 1 C培养1824h ,选用有30200个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群和大肠杆菌菌落。 大肠杆菌典型 菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落，其它细菌为无色或黄色 菌落。总大肠菌群=蓝色菌落+紫色菌落+粉红色菌落大肠杆菌=蓝色菌落+ 紫色菌落4、对可疑大肠杆菌菌落可划线接种到营养琼脂平板上， 36 ± 1 C 培养12-16小时，挑取单菌落做大肠杆菌全套生化试验 （本公司有 生化鉴定管套装20支x3种）质量控制7 / 10下载文档可编辑1、外观此干燥培养基的粉末均匀，具有良好的流动性，呈淡红色。制备好的 平板呈透明粉红色固体培养基。2、微生物试验在36 ± 1 C培养1824h小时：质控菌株ATCC生长情况菌落颜色单增李氏菌27853-/+无色金黄色葡萄球菌25923-/+8 / 10下载文档可编辑无色大肠杆菌25922 + 蓝色沙门氏菌+无色大肠菌群+粉红色方法