井冈霉素高产的比较功能基因组研究

1、井冈霉素高产的比较功能基因组研究井冈霉素是我国自主开发、应用面积最广、产业化最为成功的农用抗生素之 一，主要用于防治水稻纹枯病，同时也是糖尿病治疗药物伏格列波糖合成的重要 前体，具有较高的产品附加值。井冈霉素产生菌吸水链霉菌井冈变种是上世纪 70年代由沈寅初院士从井冈山地区分离到的，具正常生长温度为30C,但在发酵温度为37c时，产量有大幅度提高。在摇瓶发酵条件下，实验室菌株5008的产量约为2克/升，经过四十年的传 统诱变育种，其衍生的工业菌株 TL01产量达到18克/升，在工厂发酵罐中甚至 高达30克/升，发酵周期仅为2天。因此，该类菌株具有产量高、发酵温度高和 发酵周期短等优良特性，这为

2、通过比较功能基因组学研究揭示井冈霉素的高产机 制提供了极佳的研究材料。本论文主要分为以下四个部分。第一部分井冈霉素产生菌5008基因组完整图谱的构建与解析利用454测序技术测定了菌株5008的基因组序列，使用各种 文库（6-8kb质粒文库和fosmid文库）末端序列信息、数据分析与基本分子生 物学实验进行了草图中缺口的填补，并结合特殊的末端片段克隆方法识别了 5008基因组的四个端粒，成功构建了 5008基因组的完整图谱。除了大小为10,145,833bp线型染色体外，通过脉冲场电泳还发现了 164,566bp的线型质粒，同时结合大质粒提取和电泳分析还确认了73,285bp的环型质粒。链霉菌基

3、因组的比较分析发现，5008染色体有着相对较小的核心区（5.56Mb）、最短的末端反向重复序列（14bp）,并编码了更多（比例）的a/0 水解酶、MFS专运蛋白和镁离子/钮离子依赖的磷酸酶。还编码了 29个聚酮（PKS、非核糖体肽类（NRPS、杂合聚酮-多肽（PKS-NRPS菇类（terpene ）、硫肽类（lantibiotic ）等次级代谢产物，其中只有井冈霉素和环嚷哇霉素合成基因簇得到确认。另外，我们重建了井冈霉素合成前体相关的 初级代谢通路，碳源前体为7-磷酸景天庚酮糖和UDP葡萄糖，氮源前体可能为 谷氨酸。分析发现5008存在两个UDP葡萄糖合成酶白编码基因（ugp）,用于提供糖 基

4、合成井冈霉素，而其它已测序的链霉菌只编码一个ugp0第二部分井冈霉素生物合成温度调控的转录组研究通过基因组芯片技术，我们分析了 5008在30c与37c条件下的转录谱变化，在37c分别有701个上调和841个下调的差异表达 基因。鉴于阿维链霉菌NRRL8165t 5008有着更多的同源基因，且不存在抗生素合 成的温度调控现象，我们开展了在同样发酵条件下的NRRL8165专录组分析，在37c下分别有422个上调和611个下调的差异转录基因。除去共同的差异表达基 因并在更严谨参数的筛选下，5008分别有122个上调和237个下调的显著差异 表达基因，其中氨基酸转运和代谢、无机离子转运和代谢中具有更

5、多的显著下调 基因。在次级代谢中，除了糖基转移酶 ValG、转运蛋白ValH和双组份调控蛋白 ValPQ外，井冈霉素基因簇中其它基因的转录水平有着 4-23倍的显著上调，另 外还发现有3个次生代谢合成基因簇的整体转录水平发生显著上调。在初级代谢 中，第一，糖酵解中6-磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和丙酮酸激酶基因 的转录水平略有下调，同时葡萄糖酸激酶和柠檬酸裂解酶显著上调，这暗示37C发酵条件下糖酵解和三竣酸循环的代谢速率降低，碳代谢流量发生改变并更多地 进入到磷酸戊糖途径。第二，一些关键氮代谢基因，如谷氨酰胺合成酶GlnA和氮代谢调控蛋白GlnR, 在37c是显著下调的，而催化2-酮戊二

6、酸生成谷氨酸的谷氨酸脱氢酶是上调的， 这暗示5008在37C时处在高浓度谷氨酸环境下。 进一步利用氨基酸分析仪发现 5008胞内谷氨酸浓度在37c时仅有30c的十分之一，而谷氨酰胺的浓度较为接 近，这暗示谷氨酸作为氮代谢前体在 37C条件下主要用于合成井冈霉素。在22个显著差异转录的调节基因中，一个SARPC族转录调节基因SHJG0322 的转录展现出最高的温度敏感性（128倍）。该基因缺失突变株JG27在30c条件 下井冈霉素产量接近于菌株5008,而在37c条件下其产量不到5008的20%转录分析结果显示valA和valK在37c分别上调了 100倍和26倍，而在JG27 中都只上调了 6

7、倍。分别使用红霉素抗性基因强启动子和天然启动子控制下的 SHJG0322寸JG27进行回补，发现回补菌株在 37c条件下产量都上升到5008的 80姒上。这表明SHJG0322乍为正调节基因参与了井冈霉素合成的温度调控。第三部 分基于比较组学的井冈霉素高产机制解析我们进一步测定了工业菌株TL01的基因组序列，其染色体大小为 9.84Mb,比菌株5008小305.76kb。主要差别在于靠近染色体左臂的三个大片段的缺失，大小分别为78.98kb、144.01kb和79.63kb ,共编码了 234个蛋白，其中有61个转座酶、18个调控蛋 白、16个转运蛋白、28个水解酶和56个未知功能蛋白。我们在

8、5008中分别敲 除了这三个区域，其产量从4.7克/升分别提高到7.5克/升、7.6克/升和13.9 克/升。在同时缺失三个区域的多重突变株中，产量继续提高到14.9克/升，接近工业菌株产量的80姒上。另外，两个基因组中还存在 33个InDel和90个SNV立点，除了在井冈霉素结构基因间隔区，还位于78个已知功能基因（编码了 18个转录因子、39个初级代谢相关酶和8个转运/膜蛋白等）和24个未知功能基 因的内部或上游区域。第一,在工业菌株井冈霉素基因簇中，反向排布的 valABC与valKLMN操纵 子之间存在137bp缺失；第二，对其中的7个调节基因进行敲除，突变株产量都 有不同程度的提高（

9、5.6-13.3g/L ），表明发生遗传变异的调节基因降低了对井冈 霉素合成的严谨调控作用；第三，初级代谢中关键酶（柠檬酸合成酶、尿黑酸双 加氧酶和乙酰/丙酰-CoA竣化酶）发生遗传突变降低了三竣酸循环的代谢速率， 使得工业菌株代谢流量发生变化。井冈霉素高产是其产生菌基因组和外界发酵环 境相互作用的结果，除了研究5008在30c和37c条件下的转录谱变化，我们还 开展了 5008和TL01分别在低产普通发酵培养基（YMGffi高产工业培养基（IND） 中的转录组分析。TL01相比5008在YMGF口 IND条件下分别有942个和1772个差异表达基因 （DEGS。然而相比YMG 5008和TL

10、01在IND条件下的DEG分别达到5314个和 4761个，显示出不同培养基对基因表达的巨大扰动。不考虑培养基变化，TL01相比5008有282个共同的DEGs其中仅有菇类和 环曝哇霉素基因簇的转录显著上调。而在糖异生途径中两个关键酶果糖1,6-二磷酸和磷酸烯醇丙酮酸竣激酶平均分别上调 5.1倍和16.8倍。另外，共同下调的131个DEG即绝大多数由三个缺失区域与线型质粒编码。 有趣的是，相比5008, TL01仅在IND条件下出现染色体区域性的转录谱变化， 即在染色体左末端到大片段缺失区域III这一段接近1.9Mb的区域内，只有井冈 霉素和PKS-II型的基因簇是转录上调，其余都是转录下调的

11、，线型质粒编码基因显著下调，同时脉冲场电泳发现线型质粒在TL01中有着更低拷贝。不考虑菌株变化，相比YMCM养环境，在IND条件下有3749个共同的DEG§ 其中井冈霉素合成基因的转录显著上调， 平均提高超过100倍。另外，我们还发 现线型质粒和环型质粒基因在IND条件下都是显著上调的。因此，菌株（遗传）变化可选择性地调节基因组的转录，使得一些消耗能量 的区域（如线型质粒和一些染色体非必需区域） 转录显著下调，同时少量初级代 谢基因转录发生显著变化使其代谢流发生转向，有利于井冈霉素的合成。而培养基（环境）改变对菌株影响更大，相应地带来更多能量，除了显著诱导激活井冈 霉素合成基因外，还可以保证其内源质粒进行高效复制。第四部分组学分析基础上的井冈霉素工业菌株的正向工程改造基于以上组学分析，我们考虑初步从系统的水平改造工业菌株TL01。一方面利用Cre-LoxP的特异性重组系统对在TL01中整体转录下调的大片段区域进行了缺失，突变株 产量没有显著提高，但生长较为迅速，积累了更多生物量，表明该菌株代谢更为 旺盛。另一方面，通过高温与超低浓度的SDSK用方法将线型质粒进行消除。首先 对菌株5008进行线型质粒消除，得到的两个突变株产量都有明显增加，分别提 高了 48.6% 37.2%。随后，进一步对工业菌株TL01进行线型质粒消除，其产量