85分光光度法和光散射

1、<851>分光光度法和光散射紫外、可见光、红外、原子吸收、荧光、比浊法、浊度法和拉曼测量吸收分光光度法是一个化学物质的电磁辐射和分子或原子之间相互作用的 测量方法。常用于药品分析的技术，包括紫外、可见光、红外和原子吸收光谱法。 可见光区域的分光光度法测量以前被称为比色法， 然而，只有当考虑色彩知觉时， 用比色法这个术语才更准确。荧光光度法是测量暴露在紫外、可见光或者其他电磁辐射中的化学物质所发 射出的光。一般来说，荧光溶液在发射光波长长于激发光波长20至30nm左右,发射光有最大强度。光散射包含散射光的测量，是由于溶液的亚显微的光学密度不均一性，可以测量分子量从1000至数亿间的多

2、分散系统的平均分子量，两个应用于药物分析 的技术是比浊法和浊度法。拉曼分光光度法(无弹性的光散射)是试样在强烈的单色光(通常是激光) 辐射下的光散射过程，从样品散射的光被用来分析频移。这些测量方法可用的波长范围从紫外光的短波长延伸至红外。为便于参考， 这个光谱范围大致划分为紫外(190380 nm)、可见光(380780 nm)、近红外(7803000 nm)和红外(2.5-40 盯1 或 4000250cm-1)。光谱范围的比较效用对于很多药品，在紫外和可见光区域的光谱测量比近红外和红外区域要更准 确和灵敏。当溶液在1cm的吸收池观察时，浓度约为10闿/mL的溶液会在紫外 或可见光区域产生0

3、.20.8的吸光度。在红外和近红外区，要产生足够的吸光度， 各需要110 mg/ml和多达100 mg/ml的浓度。对于这些光谱范围，通常使用从 0.01mm到3mm以上的吸收池长度。物质的紫外可见光光谱一般没有高专一性。 然而，它们非常适用于定量测定， 且对于很多物质而言，可以用作鉴别的辅助手段。在药物分析中使用近红外光谱学的兴趣在提高，尤其是对于大量样品的快速 鉴别和水分测定。近红外区域尤其适合于-OH和-NH基团的测定。如乙醇中的水、胺类存在 下的-OH、姓:类中的醇类和叔胺存在下的伯胺和仲胺。除了具有相同光谱的光学异构体，任何给定化学物质的红外光谱是独一无 二的。但是，在给定的固态化合

4、物的红外光谱中，多形性会偶尔造成差异。结1 / 11构上小小的差异经常会导致光谱中的显著差异。由于在一个红外吸收光谱中有 大量的最大值，对于由已知性质的组分组成的混合物，不预先分离，有时有可 能定量测量出个别成分。虽然光谱的强度由不同分子的性质所决定，拉曼光谱和红外光谱的数据相 似。拉曼和红外光谱学对不同的功能基团显示不同的相对灵敏度，如拉曼光谱 学对C-S或C-C多重键特别敏感，而一些芳香族化合物更容易通过拉曼光谱鉴 别出来。水的红外吸收光谱很强，但是拉曼光谱很弱。因此，水能用来检查含 水溶质的红外“窗口”很有限，而水的拉曼光谱几乎完全是透明的且用于溶质 鉴别。拉曼光谱学的两个主要局限性，一

5、是样品的最低检测浓度一般为10-1M10-2M ,二是很多物质中的杂质能发出荧光， 干扰拉曼散射信号的检测。光反射测量提供的光谱信息与透射测量得到的类似。因为反射测量只探测 样品的表面组分，排除了由光学厚度引起的困难和物质的光散射性。因而，反 射测量用于强吸收物质更为简单。用于红外反射测量的一种特别常见的技术， 称为“衰减全反射" （ATR）,也称为“多重内反射" （MIR）。在ATR技术中， 红外光谱仪的光束，经过恰当的红外窗口材料（如 KRS-5,一个TIBr-TII低共熔 物），它以这样的一个角度被切断，红外光束进入窗口的第一个（前）面，但是 当它碰撞第二个（后）面时

6、完全反射（第二个面上的光线入射角超过那种材料 的临界角）。通过恰当的窗口材料，在红外光束穿过窗口前，有可能有很多内反 射。如果样品与窗口沿着完全反射红外光束的那边紧密接触地放置，则样品在 每个波长（频率）处吸收的反射辐射的强度都降低。因而，通过红外光束在窗 口里的反射次数，相对于简单的反射测量， ATR技术提供了一个强度增加的反 射光谱。ATR技术提供良好的灵敏度，但它的重现性差，而且不是一个可靠的 定量技术，除非有内标与每一个测试样品密切混合。荧光分光光度法比吸收分光光度法更灵敏。在吸收测量中，样品透射率是与空白作比较，而在低浓度下，两种溶液都产生高信号。相反，在荧光光度法中， 溶剂空白输出

7、低而不是高。因此在低浓度时，会干扰测定的背景辐射很少。而很 少化合物在低于10-5M的浓度能通过光吸收测定。在荧光分光光度法中，采用 10-7M10-8M的浓度很正常。原理和术语辐射光束穿过吸收介质时，能量会发生衰减，这与它在穿过介质过程中的光路长 度以及介质中的吸收性分子或是离子的浓度有关。 这两个因素决定了总入射能量 出现的比例。当单色光辐射穿过均匀吸收性介质时， 减少的能量可以通过比尔定 律进行定量计算：10g10（1/T）=A=abc,其中各术语定义如下：吸光度（符号A）一透光率（T）倒数的常用对数值。【注意一以前的描述性术 语包括光密度、消光度和消光】吸光系数（符号a）吸光度（A）除

8、以供试品溶液中被测物质浓度（c,单位 为g/L）和吸收路径（b,单位为cm）之商。【注意一不要与吸光度指数、比2 / 11消光系数和消光系数混淆】摩尔吸光系数（符号）一吸光度（A）与供试品溶液中被测物质浓度（单位为 mol/L）和吸收路径（单位为cm）之商。同时也是吸光系数（a）t被测物质分子量 的乘积。【注意一以前使用的术语包括摩尔吸光度指数、摩尔比消光系数和摩尔 吸收系数】对于吸收分光光度法中所用的大多数系统， 物质的吸光系数是一个常量，独立 于入射辐射的强度、池内径和浓度，在某浓度下的结果可光度测定。比尔定律没有指出温度、波长或溶剂类型的影响。对于大多数情况下，温度正 常变化的影响可以忽

9、略不记。比尔定律的偏差可能是由于化学或仪器变量。比尔定律的多次失败可能是由于 因溶质分子或溶质与溶剂分子之间的缔合或离解或离子化导致溶质分子的浓度 变化造成的。其他偏差可能是由于仪器的影响，如多色辐射、狭缝宽度效应或杂 散光。即使是给定溶剂在固定的温度下，吸光系数也不是真的恒定不变。 然而，当样 品只含有一个吸收成份时，吸收系统没必要符合比尔定律用于定量分析。未知的 浓度可通过与实验测定的标准曲线相比较而得出。虽然在最严格的意义上说，比尔定律不约束原子吸收分光光度法， 因为池长度 和浓度缺乏定量性，在可重现吸气条件下发生在火焰中的吸收过程原则上遵照比 尔关系式。 具体来说，透光率的负对数或吸光

10、度与吸收系数成正比，因此，与 吸收原子成正比。在此基础上，可建立校正曲线以评估依据溶液中元素的浓度的 未知吸收值。吸收光谱一是吸光度或吸光度函数按波长或波长函数绘图的图形表示。透光率【符号T】一样品透射的辐射功率除以入射到样品的辐射功率之商。【注意一以前使用的术语包括相对透射比和透射。】荧光强度【符号II 荧光活性的实验表达可以任意单位给出，与检测器响应 成正比。荧光发射光谱是由活性物质射出的辐射光谱分布的图形表示，发射辐射的强度为纵坐标，波长为横坐标。荧光激发光谱是激活光谱的图形表示，由活性物质射出辐射的强度为纵坐标，入射（激活）辐射的波长为横坐标。在吸收分光光度法中，包含在有机化合物荧光的

11、电磁光谱的重要区域为紫外、可见光和近 红外，如250800 nm的区间。分子吸收辐射后，能量转化为热而丧失或者以 与吸收辐射相同或更长波长的辐射释放。 辐射的吸收和发射是由于分子不同能量 水平或轨道之间的电子跃迁。光的吸收和发射之间有一个时间延迟，这个间隔， 即激发状态的持续时间，对于大部分的有机荧光溶液，已测出约为10-9 10-8秒。 荧光的短寿命使这种类型发光与磷光相区别，磷光是历时长久的余光，其寿命为从10-3秒到多达几分钟。3 / 11混浊符号S悬浮颗粒物的光散射效应。悬浮物质的数量可通过观察透射 光（比浊法）或散射光（浊度法）来测定。浊度【符号一在光散射测量中，浊度是测量每单位长度

12、给定悬浮液入射光束强度的降低。拉曼散射活性一是控制无规定向样品观测拉曼带强度的分子性质（单位为cm4 / g）0散射活性可通过分子极化率相对于产生拉曼位移带的分子运动的衍生 物测定。一般来说，拉曼带强度与分析物的浓度成正比。对照品的使用除了少数例外，药典分光光度法试验和含量测定要求以美国药典对照品作对 比。这是为了确保测试样品和对照品在相同的条件下进行测量。这些条件包括波长设置、裂缝宽度调整、池的安放和校正和透射水平。应该注意的是，在给定的 波长处显示恒定透射率的样品池， 在其他波长下，透射率会有很大不同。在需要 的地方应该建立和使用适当的池校准。用于含有分光光度法的试验和含量测定中的表示语“

13、相似的制备”和“相似 的溶液”，表示对照样品，一般是美国药典对照品，是以测试样品所使用的同样 方式来制备和观察的。通常在制备特定的对照溶液时，制备近似（如在10%范围 内）所需浓度的溶液，在准确称重的基础上计算吸收率， 如果没有使用预先干燥 的对照品，则在无水基础上计算吸收率。用于含有分光光度法的试验和含量测定中的表示语“同时测定”和“同时测量”，表示含有测试样品的溶液和含有对照品的溶液，这两者的吸光率，都与特 定的试验空白相关，是快速连续测得的。设备很多种分光光度计都可使用。基本上，大多数类型，除了那些用于红外光谱 仪的，能使实质性单色辐射能以适当的形式通过样品和测量透过部分的强度。傅里叶变

14、换红外光谱仪借由干涉技术使多色辐射通过分析物后依据强度和时间到 达检测器。紫外、可见光和分散的红外分光光度计包含一个光源、一个分散装置 （如一个棱镜或光栅）、用来选择波长带的狭缝、测试样品的池或座、一个辐射 能检测器、一个联合的放大器和测量装置。在二极管阵列分光光度计中，光源通 过测试样品然后通过一个光栅被分散到几百个光敏感的二极管上，每个二极管在其小波长间距轮流产生一个相称于光子数目的信号， 这些信号然后或许以一个快 速选择的间隔被计算出来，来显示一个完整的光谱。傅里叶变换红外系统利用一 个干涉仪代替分散装置和数字计算机来处理光谱数据。一些仪器由人工操作，其它则配备自动化和连续记录。和数字计

15、算机连接的仪器还能添加和存储光谱，进行图谱比较和执行不同的光谱学（通过数字吸光度减法实现）。4 / 11在可见光、紫外可见光、可见光、紫外和近红外与红外区域的光谱中都可用 到仪器。分光光度分析法和要用的仪器类型取决于这些因素，如现有的待测样品的组成和数量、精确度、敏感度、所需选择性和样品处理的方式。用于原子吸收分光光度法的装置具有一些特征。对于待测的每个元素，必须 选择发射被吸收的光线的特定光源，该光源通常是空心阴极灯，这阴极灯当激发 时发射出所需要的光。由于待测样品元素吸收的光通常与阴极灯发射的光的波长 相同，因此空心阴极灯中的元素与待测元素相同。 仪器配备了一个抽吸器用来将 测试样品引入到

16、火焰中，该火焰通常由空气-乙烘、空气-氢气或在耐火材料情况 下的一氧化二氮-乙烘来提供。实际上，火焰是一个被加热的样品室。检测器用 于读取来自样品室的信号。燃烧时火焰产生的干扰光线，可以通过使用一个切断 光源的灯的一个确定频率的信号来抵消。检测器应该转换成交流电频率，那样， 源于火焰的直流电信号就被忽略了。 因此，检测系统只读取来自空心阴级灯的信 号的变化，该变化直接对应于测试样品中待测原子的数目。 在药典中，通常需要 在吸收部件中提供直接读数的装置。但是，如果需要校订个论中提供的计算公式， 来得出所需的定量结果时，可能会用到读取透射百分比、吸收百分比或浓度的仪 器。吸收百分比或透射百分比可通

17、过以下两等式转换成吸光度A :A=2- Log 10 （100-%吸收）或者A=2- Logio （%透射）根据所用装置的类型，读出设备可以是一个仪表、数字计算机、记录仪或打 印机。双光束和单光束装置市售可得，任何一种都适用。荧光强度的测量可以通过一个简易的滤光荧光计来测量。该仪器由一个光 源、一个粗滤器、一个样品室、一个精滤器和一个荧光检测系统。大多数荧光计 中，检测器安放于与激发光束成 90度角的轴上。这个直角几何允许激发光束通 过测试样品，而不污染被荧光检测器接收的输出信号。 但是由于溶液本身的散射 性，或如果存在灰尘或者其它固体，检测器不可避免地接收到一些激发光。滤波 器可以消除这些残

18、余散射。粗滤器选择能激发测试样品的短波长光， 而精滤器通 常是一个灵敏的截止滤波器，它允许较长波长的荧光透过而阻止散射的激发光。大多数的荧光计使用光电倍增管作为检测器， 很多类型都可使用，每种都有 与光谱区域的最大灵敏度、增益和电噪音相关的特征。光电流在仪表或记录仪上 扩大并读取。荧光分光光度计与滤波荧光计不同在于，滤波器被单色器如棱镜或者光栅取 代了。为了分析，荧光分光光度计优于滤波荧光计表现在波长的选择性、灵活性和方便性上。在这些方面，分光光度计也优于滤光光度计。很多辐射源都可使用。水银灯相对稳定，主要在不连续的波长处发出能量。5 / 11鸨灯能在可见区域提供连续的光源。高压氤灯常被用于荧

19、光分光光度计中，因为它是一个高强度的光源，能发出从紫外到红外的连续能量。在荧光分光光度计中，单色器常配备裂缝。 狭窄的裂缝能提供高分辨率和 光谱纯度，而宽大的裂缝为达到高灵敏度而不具备这些。狭缝的大小决定于激发 波长和发射波长的分离以及所需的灵敏度。用于荧光测量中的样品池可以是圆管或者矩形的类似于吸光分光光度法中 所用的池，除了四面都是磨光的。合适的分析样品量为23 mL,但是一些装置能配备容纳100300 L的小池，或者更小量的样品池。可用的光散射仪器一般由水银灯，带有能滤过强绿光或强蓝光的滤波器、 一 块闸板、一组已知透射率的中性滤光器和装在一个臂上的灵敏的光电倍增管（通过遮光外壳外的转盘

20、能使臂绕着溶液池旋转和设定成从-135o到0o再到+135o之问的任一角度）。溶液池有很多形状，如用来测量90o散射的方形、用于45。90o 和135o散射的半八边形和所有角度散射的圆柱形。由于分子量的测定需要精确 测量溶液和溶剂的折射率的差别（n-n0）/c,需要另一个仪器，示差折射计，来测 量这个微小差别。拉曼分光计包括以下主要组件：强烈的单色辐射源（常常是激光）、用来收集被分析样品散射的光的光学部件， 一（或两）个用于分散散射光和阻断强入射 频率的单色器和一个合适的光检测器和放大系统。拉曼测量简单在于大多数样品 能在熔点毛细管内直接检测。因为激光可以被锐利的聚集，只需要几微升的样品。程序

21、吸收分光光度法操作分光光度计的详细说明由供应商提供。为得到有意义和有效的结果，分 光光度计的操作员必须意识到它的局限性与误差和变异的潜在来源。必须严格遵照操作手册的这些事项，如保养、清洁、仪器校正、处理吸收池的技术以及操作 说明。下面几点需要特别强调。检查仪器的校正准确性。在使用连续光源的地方，必须注意波长和光度计的 尺度；在使用光谱线源的地方，只需检查光度计的尺度。很多光源都有合适强度 的光谱线，在选择的光谱区域中充分排列。紫外和可见光校正光谱的最好单光源 是石英-水银电弧，它在 253.7、302.25、313.1&334.15、365.48、404.66 和 435.83nm 的

22、光线可以使用。玻璃-水银电弧在300nm以上同样有用。氢放电灯的486.13 nm 和656.28 nm光线也可以使用。波长范围也可以通过合适的玻璃滤波器校正，该 滤波器在可见光和紫外区域中有有用的吸收带。含有位错混合物（一个错和位的混合物）的标准玻璃使用广泛，虽然发现含有轨的玻璃更高级。标准钦氧化物溶1 一一一 .一 液已经代替了钦玻璃1的使用。近红外和红外分光光度计中波长范围能通过使用6 / 11 吸收带易于检出，该吸收带由聚苯乙烯薄膜、二氧化碳、水蒸气或氨气来提供。对于检查光度计尺度，要用到很多标准无机玻璃滤波器和已知透射率的标准 溶液，如重铭酸钾。定量吸光度测量通常对装在盛液池中的物质

23、溶液进行。由于溶剂和池壁都吸 收光，两者对所测吸光度所作的贡献必须进行补偿。 市场上有售相匹配的吸收池， 用于紫外和可见分光光度法中，吸收池无需校正。但是，在红外分光光度法，通 常要校正吸收池的差异。在这些情况下，在成对的吸收池盛上所选择的溶剂， 在 选择的波长下测定它们吸光度的差异。显示较大吸光度的池用于测试样品，测得 的吸光度用池差异减法来校正。随着计算机化傅里叶变换红外系统的使用， 这个校正不需要进行了，因同一 个池用于溶剂空白和测试样品。但是，必须确定该池的透射性为常量。测试样品和对照品的对比最好在相关物质的吸收峰处进行。规定分光光度法 的含量测定为讨论中的物质的光谱吸收峰给出了公认的

24、波长。众所周知，不同的分光光度计会在该峰的表观波长处会有较小的变化。习惯做法需要在出现吸收峰 处的波长下进行对比。比在个论中指定波长超出土nm的差异，表明应要对仪器进行重新校正。试验准备对于使用紫外或可见光分光光度法的测量， 样品一般要溶解在溶剂中。除非 在个论中另有规定，测量都是采用 1cm路径在室温下进行。很多种溶剂适合这 些范围，包括水、醇类、氯仿、低碳的烷烧、酯类和强酸强碱的稀释液。必须注 意使用的溶剂中应没有能在所用光谱区域有光吸收的污染物。一般建议使用无水 甲醇或乙醇，或添加了甲醇但不含有苯或其他干扰杂质的变性乙醇作为溶剂。分光光度法中溶剂的质量，要保证无污染物，市场上有售。某些其

25、他分析纯级别的 有机溶剂可能含有能在紫外区域强烈吸收的痕量杂质。应该检查这些溶剂的新批 次的透明度，而且注意要使用同批的溶剂来制备测试样品、对照溶液和空白。没有溶剂在可估计厚度下在近红外和红外光谱中是完全透明的。四氯化碳(厚度多达5mm)在6 m (1666cm-1)几乎透明。二硫化碳(厚度为1mm)作 为溶剂适用到 40 m,除了 4.2 m -5.0 m (2381 cm“ to 2000 cm-1)和 5.5 m 7.5 pm (1819 cm-1 to 1333 cni1)区域，这片区域它有强吸收。其他溶剂有相对狭窄的 透明度区域。对于红外分光光度法，合适溶剂的另外一个要求是它必须对原

26、材料 无影响，通常用氯化钠制备样品。测试样品也可通过将磨碎的固体样品分散在矿 物油或用预先干燥的卤碱盐(通常是澳化钾)仔细混合制备。带有卤碱盐的混合 物可以直接检查或通过用模具压混合物得到透明的圆盘或芯块的形式。虽然无需干燥的级别有市售，澳化钾的典型干燥条件是在真空105o干燥12个小时。 在卤碱和测试样品有歧化作用发生时， 红外镜检术或矿物油分散更可取。对于合适 的材料，测试样品可以制备成平滑的薄的样品用来做红外镜检术，或者将矿物油7 / 11 分散相整齐悬浮成薄膜。对于拉曼光谱大多数溶剂都可用，普通的(不发荧光的) 玻璃样品池可以使用。电磁光谱的红外区域从0.8400卬。8002500 n

27、m(0.82.5 叩)一般认为是近红外(NIR)区域，2.5-25 pm (4000400cm-1) 一般认为是 中红外区域，25400即一般认为是远红外(FIR)区域。除非在个论中另有规 定，3800650cm1 (2.6-15 m)的区域用于确定符合个论中红外吸收的规格。在个论中给定的红外线光谱的值，字母 s、m和w相应表示强烈、中等和微 弱吸收；sh表示肩，bd表示一个键，v表示非常。这些值变化多达 0.1师或 10cm-1,取决于所使用的特殊仪器。多态性会使很多固态化合物的红外光谱发生 变化。因此，当执行红外吸收试验时，如果样品和对照品的红外光谱出现差异， 将等量的测试物质和对照品溶解

28、在等体积的合适溶剂中，在相似的容器中以完全 相同的条件蒸干溶剂，然后用残渣重复测试。在近红外光谱学中，现有关注大多围绕在分析的简易上。 样品可以以粉末形 式或通过反射技术，只需一点或无需制备来分析。符合内部规格，可以通过电脑 比较预先用对照物质获得的光谱来确定。 很多药物在某个光谱区域显示很低的吸 收性，这个区域能使入射的近红外光可以比紫外、可见光或红外光更深地穿透样 品。近红外分光光度法可用于观察矩阵修饰，若有恰当的校正，可用于定量分析。在原子吸收分光光度法中，溶剂的性质和固体的浓度必须特殊考虑。 理想的 溶剂是，对吸收或发射过程干扰最小且在火焰中产生中性的原子。如果测试样品和对照品的表面张

29、力或粘度存在显著地差异，溶液以不同的速率被抽吸或雾化， 导致产生的信号中出现显著的差异。 溶液中酸的浓度也影响吸收过程。 因而，制 备测试样品和对照品的溶剂必须一样或在这些方面尽可能的相似。而且生成的溶液应该能易于通过抽吸喷灯的样品管道被抽吸。由于溶液中存在的不溶固体会引起矩阵或体积干扰，所有溶液中不溶固体的总量应该尽可能保持在2%以下。计算吸收分光光度法在含量测定或试验中的应用一般需要使用对照品。在含量测定规定这种测量时，会提供一个公式用于计算所需结果。公式中经常含有一个数 字常量。下面的推导为个论中含量测定的公式中出现的常量提供逻辑方法的推 演。比尔定律关系式在测试溶液(U)和对照溶液(S

30、)中都有效。(1) As = abCs Au = abCu其中，As是浓度为Cs的对照溶液的吸光度，Au是浓度为Cu的测试溶液的 吸光度。如果Cs和Cu单位相同，而且使用相同尺寸的匹配池测定吸光度，吸 光率a和池厚度b相同。总之，两个等式可以组合重写以求出Cu:（3） Cu = Cs (Au/As)8 / 11固体测试样品的定量分析一般规定以 mg为单位。稀释说明会在含量测定中 给出，且由于稀释溶液用于吸光度测量，浓度通常以闻/mL为单位。取一定量（单位为mg）药物或固体剂型的测试样品作分析，因此，浓度为Cu、体积为Vu （单位为L）的溶液可由含有数量为 Wu （单位为mg）药物的测试样品来制

31、 备。注意一Cu无论以 国/mL还是mg/L为单位，在数字上相同可得：（4） Wu = VuCu在固状物质个论中含量测定里出现的公式形式，可以通过将方程式（3）的Cu代入方程式（4）中得到。总之，使用方程式（4）,考虑到所需的单位转换得 出方程式（5）,可计算在最终公式里的常量因子（Vu）:（5） Wu = VuCs （Au/As）相同的推导适用于利用吸收分光光度法测定含量的液状物质个论中出现的 公式。对于液体剂型，计算的结果通常表示为每毫升物质中原料药的数量（单位为毫克）。因而在标准中包括另外一个术语，采用的测试样品的体积（V）单位为mLo在可见光区域的含量测定通常需要同时比较按含量测定配制

32、产生的吸光度 和接近似等量美国药典对照品配制的对照溶液产生的吸光度。标准配方中包含大 约等同于一个美国药典参考标准的量。 在某些情况下，允许不使用对照品。如在 常规频率下做分光光度法含量测定，和存在一个合适的标准曲线，该曲线分别由 美国药典对照样品制成，而且含量测定的物质遵从比尔定律，试验浓度在终浓度 的75%125%之间。在这些条件下，含量测定中的吸光度可以插入到标准曲线中， 计算出含量结果。这些标准曲线应该经常确认，和当使用新的分光光度计和新批试剂时也要确 认。在指示配制和使用标准曲线的分光光度法含量测定中，更可取的是，当含量测定不是经常进行，不用标准曲线，而是与和样品同样处理的近似等量对

33、照品 的量直接对比。荧光分光光度法荧光法测量是一个很有用的分析技术。荧光是吸收光辐射达到激发状态下的 物质发出的光。一个物质能发荧光表明它有荧光性。很多化合物能通过利用他们 固有的荧光性或合适衍生物的荧光来测定。由于以下原因，荧光分光光度法制备的样品通常只需要用于吸光光度法的十 分之一或百分之一的浓度。在分析应用中，荧光信号最好与浓度线性相关，但是 如果测试样品浓度太大，很大一部分入射光被池表面附近的样品吸收， 而达到中 心的光减少。就是说，样品本身充当了一个内部过滤器。然而，荧光分光光度法本身是一个高灵敏度的技术，常采用10-5M10-7M的浓度。在任何分析程序中，9 / 11必须做荧光强度

34、对浓度的标准曲线来建立线性关系所有的读数应该用溶剂空白校正。荧光光度法对测试样品中存在的灰尘和其他固体颗粒敏感。 这些杂质会降低 激发光束的强度或由于样品池中的多重反射而给出误导性的高读数。 因此通过离 心排除固体颗粒是明智的，也可以通过过滤，但是一些滤纸含有荧光杂质。温度调节在荧光分光光度法中很重要。对于某些物质，随着温度每一度的上 开，荧光效率会降低多达1%2%。在这种情况下，如果需要最大的精确性，可 以用控温的样品池。对于日常分析，应快速测量，使样品不会因暴露在强烈的光 源下明显升温。很多荧光性物质对光敏感。暴露在荧光计中，它们可能会光解为 更多或更少荧光性的产物。这些影响可以通过观察检测器