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文档简介
1、免疫室乙肝两对半操作规程一、试验原理“乙肝两对半”指乙型肝炎病毒表面抗原(HBSAg、乙型肝炎病 毒表面抗体(HBSAb、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg、乙型肝炎病毒 e抗体(HBeAb、乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb此五项指标,目 前国内医院最常用的乙肝病毒感染检测血清标志物, 判断是否感染乙 肝与粗估病毒复制水平初步检查。两对半中各项试验反应原理如下:1 、乙型肝炎病毒表面抗原检测:采用ELISA “双抗体夹心法”原理,用抗-HBs包被板条,用HRP 标记抗-HBs为 酶标记物,以四甲基联苯氨(TMB和过氧化物为底 物。当标本中存在HBSAg时,该表面抗原与包被抗-HBs结合并与抗 -H
2、Bs-HRP吉合形成抗-HBs-HBSAg抗-HBs-HRP复合物,加入TM璐物 产生显色反应,反之则无显色反应。在试验结束时,有颜色变化的, 提示有HBSA赤在,无颜色或颜色变化微弱的,则提示不存在HBSAg2 、乙型肝炎病毒表面抗体检测:采用ELISA “双抗原夹心法”检测人血清或血浆中的抗 -HBS,采 用HBSA包被反应板,加入待测标本,同时加入HBSAg-HR进行孵育。 当标本中存在抗-HBS时,该抗体与包被的HBSAg吉合并与酶结合物 形成HBSAg抗-HBS-HBSAg-HR复合物,洗去游离反应物,加入显色 剂,将有明显颜色变化;当标本中没有抗 -HBS时,加入底物后没有 或只有
3、很轻微的颜色变化。乙型肝炎病毒e抗原检测:采用ELISA “双抗体夹心法”检测,用单抗-HBe包被板条,用 HRPfe记抗-HBe为酶标记物,以四甲基联苯氨(TMB和过氧化物为 底物。当标本中存在 HBeAg寸,该HBeAgW包被抗-HBe结合并与抗 -HBe-HRP吉合形成抗-HBe-HBeAg抗-HBe-HRPfi合物,力口入TM璐物 产生显色反应,反之则无显色反应。在试验结束时,有颜色变化的, 提示有HBeA萨在,无颜色或颜色变化微弱的,则提示不存在HBeAg4 、乙型肝炎病毒e抗体检测:采用LEISA ”中和竞争法”检测抗-HBe,用单抗-HBe包被板条, 用HRPte记的多抗-HBe
4、为酶标记物,以四甲基联苯氨(TMB和过氧 化物为底物。加入待测的标本,同时加入基因工程HBeAg和多抗-HBe-HRP,当标本中抗-HBe含量高时,则抗-HBe-HRP与HBeAg!吉合后 形成游离物被洗涤掉,加入TM璐物时显色淡,反之则显色深。在试 验结束时,无颜色或颜色变化微弱的,提示有抗 -HBe存在,显色深 时,则提示不存在抗-HBe。5 、乙型肝炎病毒核心抗体检测:采用ELISA ”竞争抑制法”检测抗-HBc,用基因工程重组HBcAg 包被板条,用HRM记的抗-HBc为酶标记物,以四甲基联苯氨(TMB 和过氧化物为底物。加入待测标本,同时加入抗 -HBc-HRP,与抗原形 成竞争结合
5、,当标本中抗-HBc含量高时,则抗-HBc-HRP与HBcA谒 合少,加入TMBK物时显色淡,反之显色深。在试验结束时,无颜色 或颜色变化微弱的,提示有抗-HBc存在,显色深时,则提示不存在 抗-HBc。二、样本要求1、无需空腹,可血清或血浆标本;新鲜标本无菌冷藏1周可用; 可冷冻保存,但避免反复冻融。样品中含叠氮钠会影响结果;高 度溶血或没完全收缩的血清样品或有微生物污染的样品可能会 引起错误的结果。2、试剂:我室“乙肝两对半”检测试剂盒由上海荣盛生物药业有 限公司提供3、设备:洗板机1台、酶标仪1台、微量振荡器1台、打印机1 台、加样器1把、吸嘴(50-250U1 )三、操作步骤1、试剂盒
6、准备试剂贮存在2-8 C冰箱,实验前应提前30min取出,使其恢复至 室温,待用。2、加样(1)准备实验所需反应孔在以上实验原理中可以看出“乙肝五项”中每个项目必须对应各自反应孔,不可错位摆放,否 则直接导致错误报告发出。(2)乙肝表面抗原:第一步,先加样本 100U1,温育30-40min; 第二步,加酶结合物50U1 (1滴),温育30min,洗板10次,加 显色剂A/B各1滴显色看结果。具体步骤:采用“两步法”,结果需用酶标仪比色,读取OD直。每次试验,每块表面抗原测试板均需要设空白孔1孔、阴性对 照孔2孔、阳性对照孔1孔、质控(最低值)孔1孔。A :样品(阴性、阳性、质控)各100ul
7、,加入各自对应的反应 孔中,封板、温育30-40minB:加酶结合物1滴(瓶身垂直滴加,挤掉前面有气泡成分),振 荡混匀30,温育30minC :洗板10次(最好中间有一次手动拍板),自来水冲洗3-5遍, 拍干D :加显色剂A B液各1滴,避光显色15min,加终止液1滴, 酶标仪上比色E :结果判读临界值(Cutoff )=阴性对口平均OD直X2.1(阴性对照OD1<0.05 ,按0.05计算;大于0.05按实际值算) 样本OD!>Cutoff值为阳性,<Cutoff值为阴性对于SAg为阳性标本,为验证结果可靠、正确性,各实验室要求, 有些将阳性标本留下重复检测,若为阳性才
8、发出报告。我科室为 提高报告时效性,让病人尽快取得结果,将SAg阳性标本随即用 胶体金方法即乙肝表面抗原试纸条代替,再次验证结果准确性, 若为阳性(与酶免结果一致)发阳性;若为阴性(与酶免结果不 符)需用酶免方法重复检测,方可发出报告。(3)表面抗体(4) e抗原(5) e抗体(6) c抗体此四项具体操作步骤大致相同,均为“一步法”,因未上酶标仪比色,无需做阴阳性对照,如下:D1 :取所需反应孔,加样50ulD2 :加各自对应酶结合物1滴(50ul),注意:“乙肝e抗体”检测(以上海荣盛试剂为例),在加完样本后,先加“中和试剂”1滴,再加“酶结合物” 1滴,不可漏加D3 :振荡充分混匀,各温育
9、30minD4 :洗板5次,流水冲洗1-2遍,拍干板孔D5 :加显色剂A、B各1滴(50ul),避光显色15minD6 :结果判读(肉眼)SAg 、eAg:显色(蓝色)为阳性,不显色为阴性eAb、cAb :显色(蓝色)为阴性,不显色为阳性严格意义来说,严格按照试剂盒说明书来操作更好。须注意“乙肝核心抗体”标本要作1: 30稀释,血清中若检测到低滴度的抗HBC,往往只表明既往感染,有流行病学意义,只有检测到高滴度抗体(1: 30)或连续检测抗体滴度升高,才作为感染指标。3、报告模式1、1.3.52、1.4.53 1.54 2.55 2.4.56 2.47、29、4.510、全阴四、注意事项1、标本尽量新鲜,血清待完全析出,避免溶血或有污染的标本2、确保加样量要准确,使用微量移液器手工加样时,每次应该更换吸嘴吸取样本3、用滴瓶滴加时,请先摇匀,并弃去1-2滴后垂直匀速滴加,避 免将其内的液体触到或溅到微孔边缘,特别是酶结合物4、尽量避免微孔中产生气泡5、封板胶纸不能重复使用6、水浴温度严格控制在37 C7、洗板时所用吸水纸请勿反复使用8、请勿使用带有纸屑的
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