16SrRNA在细菌鉴定与分类中的应用

1、题目名称： 16S rRNA 在细菌鉴定和分类中的使用学生姓名：刘 *学 号：学16304110*专 业：生物化学及分子生物学结业课程：系统细菌学2016年12月16S rRNA在细菌鉴定和分类中的使用文 U* 2016304110*华中农业大学生命科学学院，武汉摘要:由于细菌种属间生理生化特征的相似，单凭传统的表型和化学鉴 定方法已无法准确对其进行分类鉴定。随着包括PCR技术、测序技术等分子技术的不断进步，细菌的分类鉴定也由在最初的表型和化学鉴定演变到分子水 平，使人们可以通过对细菌的 DNA鉴定来达到区分种属的目的。细菌的 16S 核糖体RNA(rRNA)以其在进化上的特征性序列，基因序列

2、的保守性和存在的 普遍性，使用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一 种强有力工具。本文就16S rRNA在细菌鉴定和分类研究中的进展做一综述。关键词：16S rRNA;细菌分类鉴定；DNA测序；高级结构传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性 等方面加以鉴定。大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需 要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加 科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基 础。20世纪60年代开始，分

3、子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分 类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛使用。 在PCR技术的产生发展基础上，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限 制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因(rDNA)指纹图、16S核糖 体核糖核酸(rRNA)序列分析等。这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的 DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而 使细菌分类更科学、更精确。特别是 16S rRNA基因序列分析技术的出现，使 细菌进化和否可以通过试验研究来证实。 目前，关于PCR扩增16S rRNA基因 用于细菌分类和鉴定的研究越来越

4、多，大多数细菌的16S rRNA基因均已被测序。本文就16S rRNA在细菌鉴定和分类研究中的进展做一综述。1.16S rRNA 基因16S rRNA为原核生物的一种核糖体 RNA。目前，细菌系统分类学研究中 最有用和最常用的分子钟是rRNA,其种类少，含量大(约占细菌RNA总量的 80%),分子大小适中，在漫长的生物进化过程中，其基因序列的变化非常缓慢，可以用来标记生物的进化距离和亲缘关系具有良好的时钟性质；在结构和功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。细菌中编码rRNA基因按5、.16S.23S.5S.3方式排列的，由2个非编码的问 隔区序列（InternalTranscribed

5、Spacers ITS）分开,5SrRNA、16S rRNA 和 23SrRNA3部分组成一个RNA操纵子，作为一个单位转录，再加工成为成熟 rRNAo 16S rRNA是所有原核生物蛋白质合成必需的1种核糖体RNA ,其具 有以下特点：（1）多拷贝。每个细菌含510个16S rRNA拷贝，这使得检测敏感 性较高。（2）多信息。16S rRNA基因内部结构由可变区和保守区组成。保守区 为所有细菌所共有，可变区在不同细菌之间存在不同程度的差异，具有属或种的特异性，可变区和保守区交错排列。因此，可根据保守区设计各种细菌的通 用引物，也可根据可变区设计特定细菌的特异引物或探针。16S rRNA基因可

6、变区所含信息的种间差异，使检测具有特异性。（3）长度适中。16S rRNA编码基因长度约1500bp,包含大约50个功能域。2. 16S rRNA序列分析鉴定细菌的原理和方法通过比较各类生物16S rRNA的基因序列，从序列差异计算它们之间的进 化距离，可以绘出生物进化树。因此，16S rRNA序列分析技术的基本原理就 是从微生物样本中16S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交 获得16S rRNA序列信息，再和16S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进 行比较，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。2.1 基因组DNA的获得首先从微生物样品中直接提取总

7、DNA,对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体RNA。一个典型的细菌含有10000个20000个核糖体，而基因组DNA中rrn操纵子（即rDNA 序列）的拷贝数相对较少（原核生物一般为1个10个左右），因此，rRNA在细 胞中的含量很高，易于获得较多的模板，但是 RNA易于降解，RNA的提取技 术相对于DNA的提取较为复杂，一般研究多采用提取细胞总 DNA,但也可根 据情况选择提取rRNAo由于rRNA在死亡的细胞中很快降解，提取 rRNA通 过反转录钓取16SrDNA序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞。2.2 16S rRNA基因片段的获

8、得过去常常将提取的总 DNA经酶切后克隆到入噬菌体中建立 DNA库，进步通过16S rRNA通用探针进行杂交，筛选含有16SrDNA序列的克隆（鸟枪法)。由于PCR技术的产生和发展，现在一般采用 16S rRNA引物PCR扩增总 DNA中的rRNA序列，或通过反转录 PCR获得互补CrDNA序列后再进行分 析。采用PCR技术的优点在于不仅一次性从混合 DNA或RNA样品中扩增出 16S rRNA序列，而且方便了后面的克隆和测序。但也同样会出现PCR所固有的缺点，尤其是采用16S rRNA保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进 行扩增，可能出现嵌合产物(Chimericproduct)和扩增偏

9、嗜性现象，影响结果的 分析。2.3 通过16S rRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴定16S rRNA基因片段的分析方法主要包括以下 3种:将PCR产物克隆到质 粒载体上进行测序，和16S rRNA数据库中的序列进行比较，确定其在进化树 中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类，该方法获得的信息最全面， 但在样品成分复杂的情况下需要大量的测序工作。通过16S rRNA种属特异性的探针和PCR产物杂交以获得微生物组成信息。止匕外，探针也可以直接和 样品进行原位杂交检测，通过原位杂交不仅可以测定微生物的形态特征和丰度， 而且能够分析它们的空间分布。该方法简单快速，主要使用于快速检测，但可 能

10、出现假阳性或假阴性结果。对PCR产物进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms, RFLP)分析，通过观察酶切电泳图谱、 数值分析，确定微生物基因的核糖体型，再同核糖体库中的数据进行比较，分 析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系。3. 16S rRNA可变区序列在细菌分类鉴定中的使用研究细菌16S rRNA中含有9个可变区，命名为 V1V9区。确定某个可变区 内具有细菌种特异性的序列就可能获得细菌实验室诊断的有用靶点。除V2、V3、V4区稍长外#其他各高变区序列都很短，没有哪个高变区能区分所有细菌。 Chakravorty等

11、对110种细菌(分别来自于人体、环境及美国疾病预防控制中心 鉴定的致病菌)共113份完整的16S rRNA的V1V8区序列进行详细研究，分 别构建了基于 V1V8区序列的特异性系统树(dendrogram) 0结果显示，V1 区能区分金黄色葡萄球菌和血浆凝固酶阴性葡萄球菌；V2和V3区能将除肠杆菌科以外的细菌鉴别至属的水平，V2区尤其适合于鉴别分枝杆菌属内的菌种； V3区能很好区别嗜血杆菌属内各种细菌；V6区也能区分除肠杆菌科以外的大 多数菌种，特别是通过单核甘酸多态性(SNP)分析可将炭疽芽胞杆菌从和其 生物学性状非常相似的蜡样芽胞杆菌群细菌中区分开来；而通过V4、V5、V7和V8区序列来鉴

12、别细菌至属或菌种的可能性不大。Jacob等收集了 31株弗朗西斯菌属的细菌及96份临床分离株，通过对16S rRNAVI区37个核甘酸片段 的PCR扩增和测序#不仅能将临床或环境标本中的弗朗西斯菌属成功鉴定出来， 结合SNP分析（根据第12位核甘酸T/G不同）还可将弗朗西斯菌属的细菌分 成2个组，引起人类和动物土拉热病的土拉热弗朗西斯菌 （Francisella tularensi§ 的3个亚种均在第1组，其他几个菌种则全在第2组。因此，该方法可快速甄 别具有强传染性的士拉热弗朗西斯菌。4.16S rRNA二级结构分析在细菌分类鉴定中的使用1981年Noller等以E.coli的16

13、S rRNA为研究对象，综合化学修饰、蛋白 结合、酶切片段等实验数据，初步推断除了16S rRNA二级结构模型，首次并对该模型的特征进行了简要描述。Woese认为，早期对于rRNA二级结构的研 究都只限于部分序列，结果并不可靠。1983年，Woese等在原有的基础上，比 较分析了真细菌域、古细菌域和真核生物域 150多个物种16S rRNA全系列， 详细论述了三域生物16S rRNA二级结构的特点，发现序列比较方法不但是预 测假设结构的一个有力工具，而且有利于发现该分析的重要功能区段，同时指 出二级结构上的改变可能导致能量变化并影响到功能。随后，很多研究者也加入到16S rRNA二级结构的研究

14、中来，对其模型不断改进和完善。Neefs在1993 年简述了真细菌、古细菌和真核生物的核糖体小亚基的二级结构模式图以及相 互之间的主要区别，这对于以后的理论研究具有重要的参考价值和指导意义。Wisotzkey对芽抱杆菌属（Bacillus）的16S rRNA序列进行系统发育分析，比 较了 16S rRNA部分同源区段的二级结构，同时结合脂肪酸类型，从中划分出 一个新属：脂环酸芽抱杆菌属（Alicyclobacillus ）。国内在16S rRNA二级结构 领域的研究工作起步较晚。2003年，陈朝银等对Thermaceae# 38株菌的16S rRNA序列进行了系统分析，重点研究了 16S rR

15、NA的特征性核甘酸和二级结 构特征，将38株菌划分为18个种，此结果和NCBI中的分类基本一致。郭春 雷等对所分离得到的几株栖热菌属（Thermus）的菌株和该属一些有效发表进 行了基于16S rRNA的系统发育分析，预测并比较了 16S rRNA部分区段的二 级结构，利用内环、内环和发卡环之间碱基对数目以及发卡环的碱基数目区分 种间差异，证明16S rRNA二级结构可以用来区分种一级的分类单位。陈国忠 采用16S rRNA可变区二级结构图形分析，比较了姜氏菌属及几个相关属种可 变区二级结构的变化。可以将Jiangelle和其他种属彼此区分开，为姜氏菌属的建立提供了又一个有意义的分子指证。姜怡

16、采用16S rRNA可变区二级结构图形分析，比较了阎氏菌科阎氏菌属典型种和微球菌属亚目中几个相关科属典型 种可变区二级结构的变化。5 .细菌鉴定中存在的挑战和困难5.1 引物设计及扩增假阳性问题尽管细菌16S rRNA存在多个保守区，但没有针对哪个保守区序列设计的 PCR引物适合于扩增所有细菌。细菌、衣原体、螺旋体、立克次体等不同种类 微生物之间16S rRNA保守区虽然存在共有序列 （consensussequence但各种 类间仍存在若干碱基不同即增细菌的“通用引物”也是相对的，通常是在共 有序列的基础上设计一套引物。因此，针对被检微生物的种类不同或临床标本 不同，应选择相对应的通用引物，

17、才能达到特异扩增效果。如果引物设计不当， 还可出现和人基因组的交叉反应，导致 PCR结果错误判读。由于PCR本身的 高敏感度，极微量污染也可能出现假阳性。污染可发生在标本采集、核酸提取 乃至PCR操作各环节，尤其是在标本（脑脊液，胸，腹腔积液，心瓣膜或活 检标本等）采集环节中最易发生。因此，在 PCR扩增及其测序的各环节都必 须建立并遵循标准化操作规程（SOP）。5.2 分离株测序鉴定的筛选问题细菌16S rRNA测序鉴定需进行DNA扩增、测序和分析，其设备条件和 实验成本比传统的表型鉴定更高， 且不能对所有细菌都鉴定至种的水平， 这是 目前一般临床实验室尚未普及该项目的原因之一。Mahlen

18、等设计了一套严谨的筛选策略，如形态学和生化检测结果不一致或十分奇怪的分离株、和疾病的相关性或解剖位置不相符的分离株、 在浅层伤口或呼吸道标本存在炎性细胞时 分离出的优势菌株、尿道标本中分离出的菌量达10A410A5CFU/ml的菌株正 常时无菌体液中分离出的量很多的菌株等 $只对这些分离株进行PCR测序鉴定。 就革兰阴性杆菌和球菌而言，实际需进行 16S rRNA测序鉴定的只占其总种类 的1.6%。采用一般表型鉴定方法能正确鉴定的绝大多数分离株不需DNA测序，以符合临床细菌鉴定的低成本、省时、高效的要求。6 .总结和展望由于16S rRNA序列的保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的稳定 性

19、，序列分析的重现性极高，基于当今分析技术的改进，使用 16S rRNA作为 分子指标，可以实现快速、微量、准确简便的对微生物进行分类鉴定。分子分类正是在从研究的目的过渡到研究的手段。随着分子分类的理论和方法的日趋成熟，其已逐步成为微生物资源调查和环境生态研究的一种强有力的工具。16SrRNA基因PCR扩增和计算机分析相结合已被证明是鉴定病原菌快速、有效、 准确的方法，再加上生物芯片的不断开发，相信感染性疾病病原菌的检测将迈 上更高的台阶。参考文献1 Shang S, Chen Z , Yu X .Detection of bacterial DNA by PCR and reverse hybridizat ion in the 16S rRN A gene w i th particular