Brdu细胞增殖检测实验

1、Brdu 检测细胞增殖实验实验操作 :1铺细胞，每个 3.5cm dish 10 万个，在 37、 5%CO2孵箱中培养 72h（细胞密 度至 50-60%左右）。2 Brdu（ 5-溴-2 -脱氧尿苷）加入培养细胞中， 1mg/ml，标记 48h。（ 量： Brdu 以铺满整个 dish 底面为准。 ）3固定：PBS洗细胞爬片 3次，每次 5min，在摇床上晃动清洗， 4%PFA固定 30min。 4变性：将固定好的细胞爬片用 PBS洗 3次，每次 5min，2mol/L 的 HCl在 37条件下变性 5min，可放置于 37恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m ） 5中和：0.

2、1mol/L 的硼酸钠（ PH8.3）中和 10min，PBS洗 3次，每次 5min。（ 50r/m ） 6加入 1ml 的 0.2%TritonX-100 ，10min。7吸出 TritonX-100 ，用 PBS洗 3次，每次 5min。8加入 1ml 3%的 BSA封闭，室温 1h，可在摇床上晃动。9吸出 BSA，用 PBS洗 3次，每次 5min。10加一抗（尿嘧啶脱氧核苷 Brdu（鼠单抗） 1:200 ），用 1%BSA稀释， 4度过夜。11将孵好一抗的细胞爬片用 PBS洗 3 次，每次 10min。12加二抗（羊抗鼠 IgG/Alexa Fluor 594 1: 100 ），用

3、 1%BSA稀释，避光室温孵 育 1h。（60 r/min ）13将孵好二抗的细胞爬片用 PBS洗 3 次，每次 10min。14加 DAPI 染细胞核，储存浓度为 1mg/ml，应将 DAPI 完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为 1:1000 （用 PBS稀释），避光室温反应 10min 。15将 DAPI染好的细胞爬片用 PBS洗 3 次，每次 10min。16中性树胶封片，荧光显微镜观察， 200×镜下取 5 个视野，计数 Brdu 阳性细胞和蓝染的细胞核数目，然后进行统计分析。试剂配制：a. Brdu 的溶解 ：室温下，将 250mg粉末溶于 2.5ml 的 DMSO中，

4、储存浓度为 100mg/ml 分装，每管 120ul ，-20 保存。b. 2 mol/L HCl ：取 8.333mL 12 mol/L HCl 的浓 HCl，加入 DDW定容至 50 mL。c. 0.1 mol/L 硼酸钠：称量 1.907g 硼砂（ Na2B4· 10H2O 381.36 g/mol ），加入 DDW 定容至 50 mL，调 PH=8.3。d. 0.2% Triton X-100 ：有 0.5%的 Triton-100 （ 2.5 mL 原液溶解于 47.5 mL 的PBS中），用 PBS稀释至 0.2%。e. 3% BSA：称量 1.5g BSA ，溶解于 5

5、0 mL的 PBS中。f. 1% BSA：用 PBS稀释 3%BSA至 1%。g. 4%FPS： 4%多聚甲醛。我是用 DDW配制的，后来我发现很难溶，磁力搅拌器加热搅拌，虽然温度控制在 60以下，也总是担心多聚甲醛分解为甲醛，所以，我就总结为如下：提前配制。 4%多聚甲醛溶液（ pH7.2） 试剂：多聚甲醛（ PFA） 4g DDW 至 100ml 配制方法：称取 4g 多聚甲醛（粉末状） ，置于三角烧瓶中，加入 80mlDDW，放入 37恒温水浴箱，每隔 1-2 小时摇晃混匀， 16-24 小时 PFA会完全溶解。补充 DDW， 调节 PH值。实验原理：1. 免疫染色实验的基本原理利用固定

6、剂（ 通常是甲醛或多聚甲醛 ）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大 增加，并且利用 Triton-X-100 使得一部分膜蛋白变性， 从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异 性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可 以保证抗体识别的特异性 。二抗可以特异性识别一抗的 Fc 区域，利用二抗连接不 同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的 表达情况。2. BrdU 标记原理细胞增殖周期包括 G1、S、G2、M 4个时期，其中 S期是 DNA合成期，细胞内 DNA进行半保留复制，各种构成

7、 DNA的原料掺入到 DNA中。 BrdU 作为一种胸腺嘧 啶核苷的类似物（其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与 5 位 C 原子连接 的甲基被溴代替） ，像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的 DNA中。当细胞处于 DNA合成期（ S期）而同时又有 BrdU存在时 , 就会有 BrdU掺入新合成的 DNA中， 只要细胞不消亡，这种 BrdU就在胞核的 DNA中长期存留。掺入到 DNA的 BrdU可 通过抗 BrdU 单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示。BrdU抗体比较大，由于 DNA双链结构的位阻， BrdU 抗体无法直接与双链上的 BrdU 结合，必须先用使 DNA部分变性，这样变性了

8、的 DNA单链上的 BrdU 才能与 BrdU抗体结合，因此做 BrdU 细胞增殖实验一定要变性， 当然变性的方法包括酸解， 热解等，但是要注意变性的程度也很重要。建议采用EdU 细胞增殖检测方法，无需变性，无需酶解，无需抗体，小分子染色， 3 小时完成实验。 EdU是一种胸腺嘧 啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替 T 渗入正在复制的 DNA分子，通过基于 EdU 与 Apollo? 荧光染料的特异性反应检测 DNA复制活性，通 快速、更灵敏、更 准确。 EdU检测染料只有 BrdU抗体大小的 1/500 ，在细胞内很容易扩散， 无需 DNA 变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避

9、免样品损伤，在细胞和组 织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。该方法能对细胞周期进行迅速而稳定的测量 , 而且标记 BrdU的细胞只要不受到紫外线照射，对细胞本身没有功能损害。该技术可应用到跟踪检测移植细胞的 存活、分化和功能状态。3. DAPI 染色原理DAPI 为 4'， 6 二脒基 -2- 苯吲哚 (4 '， 6 diamidino-2 phenylindole) ，能 与双链 DNA小槽，特别是 AT碱基结合，也可插入少于 3 个连续 AT 碱基对的 DNA 序列中。当它与双链 DNA结合时，荧光强度增强 20 倍，而与单链 DNA结合则无荧 光增强现象，因此是一种简易、

10、快速和敏感地检测DNA的方法。 DAPI 的荧光强度虽较 Hoechst 低，但荧光稳定性优于 Hoechst ；其特异性较溴化乙啶 (ethidlium bromide ， EB)和碘化丙啶 (propidium iodide ， P1)高。 DAPI 的中文名称是 4，6- 联脒-2- 苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭(EB)等染色剂的机理类似：它们与 DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。 结合后产生的荧光基团的吸收峰是 358nm而散射峰是 461nm，正好 UV(紫外光)的激发波长是 356nm，使得 DAPI 成为了一种常用的荧光检

11、测信号。ANALYSIS OF CELL CYCLE1. INTRODUCTIONCell cycle and apoptosis are very important functional parameters toassess the cellular metabolism, physiology and pathology. Several techniques have been developed to quantitate these parameters utilizing the differential staining of fluorescent dyes. We are

12、 describing four different flow cytometric methods, two for the discrimination of cell cycle phases (A and B) and two for the simultaneous assessment of cell cycle and apoptosis (C and D).A) Bromodeoxyuridine/Propidium IodideThe classical method for the analysis of cell cycle distribution isthe flow

13、 cytometric measurement of DNA content which can simultaneously determine the incorporation of Bromodeoxyuridine (BrdU). The procedure requires that DNA is partially denatured to expose incorporated BrdU toa specificantibody. Denaturation is necessary because antibodiesdeveloped so far bind only to

14、BrdU in single-strand DNA. The remaining undenatured DNA is then stained with Propidium Iodide (PI). Green fluorescence from the fluorescein-conjugated antibody is a measure of BrdU incorporation. Red fluorescence from the PI is a measure ofDNA. Theprotocol described here uses high-molarity HCl for

15、the denaturation of DNA.Furthermore, this method may be utilized either for unfixed or for fixed cells in suspension.B) Cyclins/Propidium IodideCyclins are key components of the cell cycle progression machinery.In particular, the expression of cyclins D, E, A and B1 provides new cell cycle landmarks

16、 that can be used to subdivide cell cycle into severaldistinct subcompartments. In this procedure cyclins expression is detectable using specific monoclonal antibodies (mAbs), and is analysed in respect to DNA content.Generally, the peak of expression of cyclin D1 can be detected in early G1, the pe

17、ak of cyclin E is typical of G1/S transition, the peak of cyclin A can be detected during G2/M phases and cyclin B1 is typical of late G2/M. Using this method, compared to the above mentioned protocol, it is possible to distinguish G0 from G1 and G2 from M phases. However, it is necessary to keep in

18、 mind that not all cell types behave in the same manner (for example, cyclin D1 is detectable not only in G0/G1 but also in G2/M, even if in a very few cell types).C) TUNEL/Propidium IodideOne of the most used protocol for the determination of apoptosis in the different phases of cell cycle is the e

19、nzymatic in situ labeling of apoptosis-induced DNA strand breaks (TUNEL). Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) have been used for the incorporation of fluorescein-labeled nucleotides to DNAs trands breaks in situ . DNAc ontent is revealed by red fluorescence from PI. In order to have more det

20、ails, see the Chapters related to TUNEL technique.D) F-Actin/Propidium IodideThe analysis of apoptotic cells and estimation of their cell cycle specificity is also possible using a recent method. This is based on identification of apoptotic cells which have modified their cytoskleton and their DNA c

21、ontent. In specific, paraformaldehyde (PFA) fixation followed by staining of F-actin with fluorescein-conjugated phalloidin and of DNAw ith PI, are used. Furthermore, this procedure may be utilized also for adherent cells.A) BrdU/PI PROTOCOLA.2.1 Materials1. Cells (1x106 /mL) are incubated with BrdU

22、 10 mM at final concentration, for 30 min at 37°C in controlled atmosphere.2.Wash twice at 500 g for 1 min using the washing buffer.3. Resuspend in 0.5 mL of washing buffer and 0.5 mL of HCl 4 M.4. Mix accurately and incubate for 30 min at room temperature.5. Wash once as in step 2.6. Resuspend

23、 in 1 mL of Borax buffer.7. As in step 5.8. Resuspend in 200 m L of washing buffer and label with 5 m L of mAb ant-BrdU.9. Incubate for 1 hour at 4°C in the dark.10. As in step 5.11. Resuspend in 200 m L of washing buffer and label with 4 m L of goat-anti-mouse FITC-conjugated antibody.12. Incu

24、bate for 30 min at 4°C in the dark.13. As in step 5.14. Resuspend in 200 m L of washing buffer and 200 m L of PI buffer.15. Incubate for 15-30 min at 4 ° C in the dark.16. Analyse with flow cytometer equipped with a 488 nm argon laser.A.3. COMMENTARYA.3.1 Background informationIn this procedure fixed cells by 4%P FAi n Phosphate Buffer Saline (PBS) can be utilized. In this case to wash cells once in PBS before to start at step 1 is necessary.Moreover, both direct and indirect immunofluorescence can b