药用炭炭微生物限度验证方案

1、文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 1 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:目 录1.目的.32.范围.33.职责.34.参考文件.35.系统概述.46.验证用仪器、菌种和培养基.46.1 验证用仪器46.2 验证用菌种46.3 验证用培养基47.验证实施.47.1 验证文件确认57.2 需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查67.3 需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证67.4 控制菌检查用培养基的适用性检查 67.5 控制菌检查方法验证88.偏差清单及报告99.验证周期910.验证结果分析与评价报告911.验证附表10表 1 验证方案培训记录表

2、11表 2 文件的确认12表 3 菌液计数结果13表 4 需养菌总数、霉菌及酵母菌培养基的适用性检查记录14表 5 需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录15表 6 控制菌检查用培养基的适用性检查记录16文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 2 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:表 7 控制菌检查方法验证17表 8 偏差清单18表 9 偏差报告19表 10 验证结果分析与评价报告20文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 3 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:1.1.目的目的依据中国药典 （2015 年版四部）,对药用炭新

3、建立的微生物限度检查方法进行验证，以确认在目前的检验环境下该方法适合于供试品的需养菌总数、霉菌、酵母菌测定及控制菌的检查。2.2.范围范围本验证方案适用于药用炭的微生物限度检查法的验证。3.职责职责3.13.1 验证小组成员及职责验证小组成员及职责3.23.2 验证方案培训：验证方案培训：序号部门姓名职务验证小组职务工作职责1质量管理部刘国利质量副总组长1. 负责验证方案、验证报告的最终批准2. 负责验证涉及文件、资料的最终审核3. 确保完成验证项目2质量管理部邓志军质管部长副组长1. 负责验证方案、验证报告的审核2. 负责验证涉及文件、资料的审核3质量管理部胡绪勇QA 主任小组成员1. 负责

4、验证方案的起草、培训2. 负责验证工作的实施3. 负责验证实施过程中资料数据的收集、整理、归档4. 负责难证项目实施中各部门协调工作5. 负责验证报告的撰写4质量管理部饶滔QC 主任小组成员1. 负责验证检验标准、检验方法的起草2. 负责验证实施过程中检验工作的安排5质量管理部阮江为QA小组成员1. 负责验证方案、验证报告的初审2. 负责协助验证过程的实施毛亚琼6质量管理部徐秋红QC小组成员1. 负责验证过程实施2. 原始记录的填写文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 4 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:本验证方案批准后，根据人员培训标准操作规程对确认小组

5、成员和相关人员进行培训，使其了解方案的实施程序，明白其职责并能在验证工作中得到很好的执行。见表 1.4.参考文件参考文件本验证方案参考了以下标准和指南：药品生产质量管理规范 （2010 年版）药品微生物学检验技术药品生产验证指南 （2003 年版）中国药典 （2015 年版四部）5.系统概述系统概述参照中国药典 （2015 年版二部及四部）采用的检测方法对药用炭原料新建立的微生物限度检查法进行验证，以确认所采用的方法适合于供试品的需养菌总数、霉菌、酵母菌的测定和控制菌的检查。可以照此检查法和此检查条件进行供试品的微生物限度检查。6.验证用仪器、菌种和培养基验证用仪器、菌种和培养基6.1 验证用

6、仪器仪器名称生产厂家仪器型号压力蒸汽灭菌器电子天平PH 酸度计电热恒温培养箱生化培养箱微生物限度检验仪6.2 验证用菌种菌种名称菌种编号提供厂家菌种代数金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003北京三药科技开发公司第（ ）代铜绿假单胞菌CMCC（B）10104北京三药科技开发公司第（ ）代枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501北京三药科技开发公司第（ ）代大肠埃希菌CMCC（B）44102北京三药科技开发公司第（ ）代白色念珠菌CMCC（B）98001北京三药科技开发公司第（ ）代黑曲霉菌CMCC（B）98003北京三药科技开发公司第（ ）代6.3 验证用对照培养基对照培养基名称来源批号胰酪大豆胨液

7、体对照培养基中国食品药品检定研究院胰酪大豆胨琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院沙氏葡萄糖琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 5 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:沙氏葡萄糖液体对照培养基中国食品药品检定研究院麦康凯液体对照培养基中国食品药品检定研究院麦康凯琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院6.4 验证用培养基培养基名称配制批号培养温度（）胰酪大豆胨液体培养基3035胰酪大豆胨琼脂培养基3035沙氏葡萄糖液体培养基2025沙氏葡萄糖琼脂培养基2025麦康凯液体培养基4244麦康凯琼脂培养基3035PH7.0 无菌氯化钠

8、-蛋白胨缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液7.验证实施验证实施7.1 验证文件确认目的验证支持文件的确认，用来保证验证的一致性、有效性。程序检查药用炭质量标准 、 微生物限度检查法操作规程 、 培养基适用性检查操作程序及相关记录是否齐全、是否是现行批准的文件。可接收标准与本次验证相关的文件及记录齐全，均为现行版本。确认结果结果见“表 1 文件确认” 。7.2 需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查 目的确认使用的需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基适用性检查符合要求。程序 菌液制备取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中，经 3035培养 182

9、4 小时，将培养物 1ml，加入到 9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 6 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:倍稀释制成每 1ml 含菌数不大于 100 cfu 的菌悬液，备用。取白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，经 2025培养 23 天，将培养物 1ml，加入到 9ml0.9%无菌氯化钠注射液中，10 倍稀释制成每 1ml 含菌数不大于 100 cfu的菌悬液，备用。取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，经 2025培养 57 天，加入 35ml 含 0.05%（ml/ml）的聚山梨

10、酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，取此菌原液 1ml，用含 0.05%（ml/ml）的聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液9ml，10 倍稀释制成每 1ml 含孢子数不大于 100 cfu 的孢子悬液，备用。菌液计数（取 2 个平皿的平均值）：取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌 1ml分别接种至 2 个无菌培养皿中，每皿注入胰酪大豆胨琼脂培养基约 20ml，倒置于生化培养箱3035培养 3 天，计数；取白色念珠菌、黑曲霉菌液 1ml 分别接种至 2 个无菌培养皿中，每皿注入沙氏葡萄糖琼脂培养基约 20ml，倒置于霉菌培养箱 2025培养

11、 5 天，计数并取其平均值。计数培养基适用性检查胰酪大豆胨琼脂培养基 取 7 个无菌平皿，分别接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各 2 平皿，每皿接种 1ml（含菌不大于 100cfu） ，另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固后置于 3035培养 3 天，计数。取 4 个无菌平皿，分别接种白色念珠菌、黑曲霉菌各 2 个无菌平皿，倾注胰酪大豆胨琼脂对照培养基，混匀，凝固后置于3035培养 5 天，计数；对照培养基同法操作。沙氏葡萄糖琼脂培养基 取 5 个无菌平皿，分别接种白色念珠菌、黑曲霉菌各 2 个平皿，每皿接种 1ml（含菌不大于 100cfu） ，

12、另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固后置于 2025培养 5 天，计数；对照培养基同法操作。可接受标准被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在 0.52 范围内，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。确认报告结果见“表 2 菌液计数结果” 、 ”表 3 培养基的适应性检查” 。7.3 需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法的验证目的确认所采用的计数方法适合于产品的需养菌总数、霉菌及酵母菌的测定。程序 菌液制备：取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中，经 3

13、035培养 1824 小时将培养物 1ml，加入到 9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10 倍稀释制成每 1ml 含菌数不大于 100 cfu 的菌悬液，备用。取白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，经 2025培养 23 天，将培养物 1ml，加入到 9ml0.9%无菌氯化钠注射液中，10 倍稀释制成每 1ml 含菌数不大于 100 cfu的菌悬液，备用。取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，培养 57 天，加入 35ml 含文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 7 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:0.05%（ml/ml）的聚

14、山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，取此菌原液 1ml，用含 0.05%（ml/ml）的聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液 9ml，稀释制成每 1ml 含孢子数不大于 100 cfu 的孢子悬液，备用。验证步骤：取供试品 1 个批号，每批中验证试验包括 3 组进行独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的比值。平皿法（0.1ml/皿）a.试验组：取 1：10 的供试液 0.1ml 加入无菌平皿，再加入 0.1ml 含菌量不大于 100cfu 菌液，注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，分别制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌数。b.菌液组：取稀释液

15、 0.1ml，同试验组操作，测定其菌数。c.供试品对照组：取 1：10 的供试液 0.1ml，测定供试品菌数。可接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在 0.52 范围内。稀释剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值应在 0.52 范围内。试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数 试验组菌数比值=菌液对照组平均菌落数确认报告结果见”表 4 需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录” 。7.4 控制菌检查用培养基的适用性检查目的确认使用的控制菌计数培养基适用性检查符合要求。程序菌液制取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中，经3035

16、培养 1824 小时，将培养物 1ml，加入到 9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10 倍稀释制成每1ml 含菌数不大于 100 cfu，备用。适用性检查麦康凯液体培养基 分别接种 1ml（含菌不大于 100cfu）大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中，在 4244培养 2448 小时，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好；接种 1ml（含菌大于 100cfu）金黄色葡萄糖菌于被检培养基和对照培养基中，在 4244培养 48小时，试验菌应不得生长。麦康凯琼脂培养基 用涂布法分别接种 1ml（含菌不大于 100cfu）大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平皿上，在 3035培养 18 小

17、时，与对照培养皿比较，被检培养皿与对照培养皿生长的菌落大小、形态特征应一致。用涂布法分别接种不大于 100cfu 的大肠埃希菌于被检培养基和文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 8 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:对照培养基平皿上，在 3035培养 18 小时。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致RV 沙门增菌液体培养基 分别接种 1ml（含菌不大于 100cfu）沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在 3035培养 24 小时，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好；接种 1ml（含菌大于 100cfu）

18、金黄色葡萄糖菌于被检培养基和对照培养基中，在 3035培养 24小时，试验菌应不得生长。木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基 用涂布法分别接种 1ml（含菌不大于 100cfu）沙门菌于被检培养基和对照培养基平皿上，在 3035培养 18 小时，与对照培养皿比较，被检培养皿与对照培养皿生长的菌落大小、形态特征应一致。用涂布法分别接种不大于 100cfu 的沙门菌于被检培养基和对照培养基平皿上，在 3035培养 18 小时。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致。三糖铁琼脂培养基 用涂布法分别接种不大于 100cfu 的沙门菌于被检培养基和对照培养基平皿上，在

19、3035培养 18 小时。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致。可接受标准 促生长能力检查：被检培养基与对照培养基生长的菌落大小、形态特征应一致。 抑制能力检查：试验菌不得生长。 指示能力检查：被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致。确认报告结果见”表 5 控制菌检查用培养基的适用性检查” 。7.5 控制菌检查方法验证目的验证所采用的检查方法适合于产品的控制菌检查。程序菌液制备取大肠埃希菌、沙门的新鲜培养物接种至胰酪大豆胨液体培养基中，经 3035培养 1824小时，将培养物 1ml，加入到 9ml0.9%无菌氯

20、化钠溶液中，10 倍稀释制成每 1ml 含菌数不大于 100 cfu 的菌悬液，备用。1.验证步骤供试液的配制：取供试品 10g，加入 pH7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，使成1：10 的供试液。试验组：取 1ml 供试液和不大于 100cfu 试验菌加入 100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀3035培养 18 小时，取上述培养物 1ml 加入 100ml 麦康凯液体培养基中 4244培养 24 小时。取麦康凯液体培养物划线接种于取麦康凯琼脂培养基平皿上，3035培养 18 小时。阳性对照组：取 1ml 不大于 100cfu 试验菌加入 100ml 胰酪大豆胨液体培养基中

21、，混匀3035培养 1824，取上述培养物 1ml 加入 100ml 麦康凯液体培养基中。4244培养 24 小时。取麦康凯液体培养物划线接种于取麦康凯琼脂培养基平皿上，3035培养 18 小时文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 9 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:阴性对照组：取 pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 1ml 加入 100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀3035培养 18 小时，取上述培养物 1ml 加入 100ml 麦康凯液体培养基中 4244培养 24 小时。取麦康凯液体培养物划线接种于取麦康凯琼脂培养基平皿上，3035培养 18 小时

22、。 试验组：取 10g 供试品和不大于 100cfu 试验菌接种至 100 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养 18 小时，取上述培养物 0.1ml 接种至 10mlRV 沙门增菌液体培养基 3035培养 18小时取少量 RV 沙门增菌液体培养物接种于木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基平皿上，3035培养18 小时，用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基进行斜面接种 3035培养 18 小时。阳性对照组：取 1ml 不大于 100cfu 试验菌接种至 100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养 18 小时，取上述培养物 0.1ml 接种至 10mlRV 沙门增菌液体培养基 30

23、35培养 18小时取少量 RV 沙门增菌液体培养物接种于木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基平皿上 3035培养 18小时，用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基进行斜面接种 3035培养 18 小时。阴性对照组：取 100ml 胰酪大豆胨液体培养基 3035培养 18 小时，取上述培养物 0.1ml接种至 10mlRV 沙门增菌液体培养基 3035培养 18 小时取少量 RV 沙门增菌液体培养物接种于木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基平皿上 3035培养 18小时。可接受标准阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组应无菌生长。若试验组检出试验菌，则可按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若

24、试验组未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性后，重新进行验证。确认报告结果见”表 6 控制菌检查方法验证记录” 。8.偏差清单及报告整理所有验证过程中发现的偏差，并将清单列在“表 6”中。将验证过程发现的所有偏差记录在“表 7” ，并提出偏差解决方案，审核和批准偏差解决方案及其实施。9.验证周期每 5 年进行一次再验证，原测定法的检验条件发生改变时，也需要重新验证。10.验证结果分析与评价报告由验证小组组长对本方案做验证结论及建议，填写“表 8 验证结果分析与评价报告” ，验证小组成员进行会签，验证委员会主任对本方案的结论进行批准。文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 10

25、 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:表 1 验证方案培训记录表培训内容教师姓名部门职务培训时间培训地点教师签名参加培训人员签名部门姓名部门姓名文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 11 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:表 2 文件的确认文件的确认文件名文件编号存放地点药用炭质量标准微生物限度检查法操作规程培养基适用性检查操作程序结论检查人日期复核人日期文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 12 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:表 3 菌液计数结果菌液计数结果培养结果（个/ml） 加菌量菌种培养基平皿号1

26、天2 天3 天4 天5 天12金黄色葡萄球菌平均值12枯草芽孢杆菌平均值12铜绿假单胞菌平均值12胰酪大豆胨琼脂培养基大肠埃希菌平均值12白色念珠菌平均值12沙氏葡萄糖琼脂培养基黑曲霉菌平均值胰酪大豆胨琼脂培养基阴性对照/沙氏葡萄糖琼脂培养基阴性对照/结果 合格 不合格结论检查人/日期复核人/日期文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 13 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:表 4 需养菌总数、霉菌及酵母菌培养基的适用性检查记录需养菌总数、霉菌及酵母菌培养基的适用性检查记录被检培养基对照培养基比值培养结果（个/ml） 加菌量菌种培养基平皿号1天2 天3天4天5

27、 天1 天2 天3 天4 天5 天1/2/金黄色葡萄球菌平均值1/2/枯草芽孢杆菌平均值1/2/铜绿假单胞菌平均值1/2/白色念珠菌平均值1/2/胰酪大豆胨琼脂培养基黑曲霉菌平均值1/2/白色念珠菌平均值1/2/沙氏葡萄糖琼脂培养基黑曲霉菌平均值胰酪大豆胨琼脂培养基阴性对照沙氏葡萄糖琼脂培养基阴性对照结果 合格 不合格结论检查人日期复核人日期文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 14 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:表 5 需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录供试品名称批号生产厂家试验方法平皿法平均菌落数菌种加菌

28、量项目123结果试验组菌液对照组供试品对照组金黄色葡萄球菌试验组菌数比值合格不合格试验组菌液对照组供试品对照组铜绿假单胞菌试验组菌数比值合格不合格试验组菌液对照组供试品对照组枯草芽孢杆菌试验组菌数比值合格不合格试验组菌液对照组供试品对照组白色念珠菌试验组菌数比值合格不合格试验组菌液对照组供试品对照组黑曲霉菌试验组菌数比值合格不合格检查人日期复核人日期文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 15 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:表 6 控制菌检查用培养基的适用性检查记录控制菌检查用培养基的适用性检查记录试验项目促生长能力抑制能力指示能力菌种大肠埃希菌金黄色葡萄

29、球菌大肠埃希菌菌种代数第（ ）代第（ ）代第（ ）代加菌量（cfu/ml）培养基培养条件结果麦康凯液体培养基培养温度 培养时间 hr-麦康凯液体培养基培养温度 培养时间 hr-试验结果麦康凯琼脂培养基培养温度 培养时间 hr-麦康凯液体培养基阴性对照麦康凯琼脂培养基阴性对照结果 合格 不合格结论检查人日期复核人日期文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 16 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:表 7 控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证记录 1供试品名称批号生产厂家控制菌验证：大肠埃希菌供试液制备取供试品 10g，加入 pH7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至

30、 100ml，使成 1：10 的供试液。取 1：10 的供试液 1ml。培养基及培养条件试验组阳性对照组阴性对照组胰酪大豆胨液体培养基3035培养 18 小时麦康凯液体培养基4244培养 24 小时麦康凯琼脂培养基3035培养 18 小时结果 合格 不合格检查人日期复核人日期文件编号: VAP-016验证方案验证方案版本号: 页码: 17 / 21药用炭微生物限度适用性检查方案生效日期:控制菌检查方法验证记录 2供试品名称批号生产厂家控制菌验证：沙门菌供试液制备取供试品 10g，接种于 100mlTSB，混匀，培养。培养基及培养条件试验组阳性对照组阴性对照组胰酪大豆胨液体培养基3035培养 24 小时RV 沙门菌增菌液体培养基3035培养 24 小时木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基3035培养 24 小时三糖铁琼脂培养基353035培养 24 小时结果 合格 不合格检查人日期复核人日期文件编号: VAP-016验证方案验证