氟罗沙星注射液

1、沈阳药科大学成人高等教育毕业论文氟罗沙星注射液无菌检查方法学研究学生姓名： 席文娟 专业形式层次： 药学本科 学号（或准考证号）： 080319030 指导教师： 李丹 实习单位： 西安安健药业有限公司 完成时间： 2009年11月 通讯地址： 西安市周至县药厂路1号 邮政编码： 710400 联系电话（手机）：成人高等教育毕业论文诚信声明本人郑重声明：所呈交的毕业论文，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体

2、均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 毕业论文作者签名： 年 月 日目 录摘要 1第1章 引言 2第2章 实验部分21环境与仪器设备 21.1实验环境 21.2仪器与试药 21.3试验用菌株 31.4培养基 31.5冲洗液和稀释剂 32方法与结果 32.1 菌液制备 32.2 样品取样量与前处理 42.3方法验证试验 52.4方法验证试验 52.5方法验证试验62.6方法验证试验72.7样品的无菌检查 7第3章 结论 8参考文献 8致 谢 9 氟罗沙星注射液无菌检查方法学研究药学专业2008级函授专升本 席文娟摘要建立氟罗沙星注射液的无菌检查方法。本试验取氟罗沙

3、星注射液，按中国药典2005版二部收载1的“无菌检查法”项下进行试验。结果表明：采用方法验证试验进行氟罗沙星注射液的无菌检查，供试品无菌生长，而6株阳性菌生长良好，方法可行。关键词：氟罗沙星注射液；无菌检查法（薄膜过滤法）；方法学验证ABSTRACTA test method for sterility of Fleroxacin Injection was established. The test method was carried out according to the method of volume two, Chinese Pharmacopoeia Edition 2005.

4、 Three validation tests were engaged, and the third one show that all of six strains positive control tubes reveal growth of microorganism and the test control gives no evidence of growth . The method can be used to tset for sterility of this preparation .Keyword: Fleroxacin Injection ；test for ster

5、ility ；method validation tests1第一章 引言氟罗沙星注射液是一种新型的第三代氟喹诺酮类光谱抗菌药物，主要通过抑制DNA旋转酶活性，而达到杀菌作用，其具有抗菌谱广、抗菌活性强、血中浓度高、组织渗透性强、消除半衰期长等特点2。临床上主要用于对本品敏感细菌引起的急性支气管炎，慢性支气管炎急性发作及肺炎等呼吸系统感染；膀胱炎、肾盂肾炎、前列腺炎、附睾炎、淋病奈瑟菌性尿道炎等泌尿生殖系统感染；伤寒沙门菌感染、细菌性痢疾等消化系统感染；皮肤软组织感染、骨感染、腹腔感染及盆腔感染等3。本品属注射剂，为确保临床用药安全，中国药典2005年版二部附录规定需要进行无菌检查1。通过查阅

6、、参考、借鉴有关抗生素药品无菌检查方法验证文献4-6。第二章 实验部分1 环境与仪器材料1.1实验环境 （见表2.1）表2.1洁净度检测结果（温湿度：20，55%）检查项目无菌室无菌室净化台阳性对照室阳性性对照室净化台尘埃粒子数（0.5um）1066012000沉降菌数0000级别100100100100由表2.1可见，实验条件符合“无菌检查法”要求。1.2仪器与试药 HTY-601型智能集菌仪及一次性使用全封闭集菌培养器（杭州泰林生物技术设备2有限公司生产）；氟罗沙星注射液（西安安健药业有限公司，规格为2ml：0.2g，批号为20090801）。1.3试验用菌株金黄色葡萄球菌（Staphyl

7、ococcus aureus）CMCC(B)26003、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginose）CMCC(B)10104、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63501、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC(B)64941、白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(B)98001、黑曲霉菌（Aspergillus niger）CMCC(B)98003（均由陕西省食品药品检验所提供，前5株菌为第三代，黑曲霉菌为第二代)。1.4培养基（适用性检查、无菌性检查、灵敏度检查按中国药典2005年版二部附录检查均符合

8、要求）硫乙醇酸盐流体培养基（批号：0811172）、真菌（改良马丁）培养基（批号：071017）、营养琼脂培养基（批号：0811063）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：070926）、营养肉汤培养基（批号：070809）、改良马丁琼脂培养基（批号：080710）（北京三药科技开发公司）。均按中国药典2005年版二部附录的要求配制及灭菌。1.5冲洗液和稀释剂0.9%氯化钠溶液（天津市北方天医化学试剂厂）、0.1%蛋白胨水溶液（北京奥博星生物技术有限公司）。按中国药典2005年版二部附录的要求配制及灭菌。2方法与结果2.1 菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤中

9、，3035培养1824小时，用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液（营养琼脂培养基平皿法计数）；接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养1824小时，用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液（硫乙醇酸盐流体培养基平皿法计数）；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，2328培养2448小时，3用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液（玫瑰红钠琼脂培养基平皿法计数）；接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基斜面上，2328培养5天，加35ml0.9%无菌

10、氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌数小于100cfu的孢子悬液（改良马丁琼脂培养基平皿法计数）。结果见表2.2。表2.2 验证用菌液的稀释级别及接种量试验菌名称 稀释级别菌落数接种量（1ml）规定接种量试验菌名称 稀释级别菌落数接种量规定接种量金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)2600310-6851小于100cfu生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC(B)6494110-5751小于100cfu铜绿假单胞菌（P

11、seudomonas aeruginose）CMCC(B)1010410-6791小于100cfu白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(B)9800110-5831小于100cfu枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)6350110-6821小于100cfu黑曲霉菌（Aspergillus niger）CMCC(B)9800310-4701小于100cfu2.2样品取样量与前处理 参照中国药典2005年版二部附录无菌检查的有关规定1，验证实验时每一验证菌株需要的样品量相当于每一滤筒的样品量，即每管20支样品，按照无菌方法进行处理，备用。42.3方法验

12、证试验取一次性全封闭集菌培养器（两联）一套，将2.2项下的样品按薄膜过滤法滤至一管中，于最后加入小于100cfu的试验菌，加入100ml相应的培养基于滤筒内作为试验管；另一管加入相应的试验菌及培养基作为对照管。再取硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基分别泵入另两管一次性全封闭集菌培养器中，作为阴性对照管。按规定温度将上述一次性集菌培养器培养35天（硫乙醇酸盐流体培养基置3035培养，改良马丁培养基置2328培养）。各试验菌同法操作，结果见表2.3。表2.3 方法验证试验试验结果金黄色葡萄球菌试验 对照铜绿假单胞菌试验 对照枯草芽孢杆菌试验 对照生孢梭菌试验 对照白色念珠菌试验 对照黑曲霉菌试验

13、 对照阴S G 注：S表示硫乙醇酸盐流体培养基G表示改良马丁培养基。 表2.3中结果显示两霉菌正常生长，细菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢菌、生孢梭菌）均不能生长，显示本品的抑制作用将对无菌检查结果的判断有影响，应考滤使用一定量冲洗液和中和剂消除干扰。2.4方法验证试验取一次性全封闭集菌培养器（两联）一套，取少量冲洗液润湿滤膜，先将2.2项下的样品按薄膜过滤法滤至一管中，用0.1%蛋白胨水溶液（含0.1mol/L MnSO45ml）冲洗，分3次冲洗，每次100ml，并于最后一次冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤，加入100ml相应的培养基于滤筒内作为试验管；另一管加入相应的试

14、验菌及培养基作为对照管。再取硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基分别泵入另两管一次性全封闭集菌培养器中，作为阴性对照管。按规定温度将上述一次性集菌培养器培养35天（硫乙醇酸盐流体培养基置3035培养，改良马丁培养基置2328培养）。各试验菌同法操作，结果见表2.4。5表2.4 方法验证试验试验结果金黄色葡萄球菌试验 对照铜绿假单胞菌试验 对照枯草芽孢杆菌试验 对照生孢梭菌试验 对照白色念珠菌试验 对照黑曲霉菌试验 对照阴S G 注：S表示硫乙醇酸盐流体培养基G表示改良马丁培养基。 经每管用300ml0.1%蛋白胨水溶液（含0.1mol/L MnSO45ml）冲洗后，铜绿假单胞菌在48小时内生长

15、，金黄色葡萄球菌在第四天生长，枯草芽孢菌和生孢梭菌仍未生长，表明本品的抑菌作用仍未消除，需进一步加大冲洗液用量。2.5方法验证试验 取一次性全封闭集菌培养器（两联）一套，取少量冲洗液润湿滤膜，先将2.2项下的样品按薄膜过滤法滤至一管中，用0.1%蛋白胨水溶液（含0.1mol/L MnSO45ml）冲洗，分5次冲洗，每次100ml，并于最后一次冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤，加入100ml相应的培养基于滤筒内作为试验管；另一管加入相应的试验菌及培养基作为对照管。再取硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基分别泵入另两管一次性全封闭集菌培养器中，作为阴性对照管。按规定温度将上述一次性集菌培

16、养器培养35天（硫乙醇酸盐流体培养基置3035培养，改良马丁培养基置2328培养）。各试验菌同法操作，结果见表2.5。表2.5 方法验证试验试验结果金黄色葡萄球菌试验 对照铜绿假单胞菌试验 对照枯草芽孢杆菌试验 对照生孢梭菌试验 对照白色念珠菌试验 对照黑曲霉菌试验 对照阴S G 注：S表示硫乙醇酸盐流体培养基G表示改良马丁培养基。6经每管用500ml0.1%蛋白胨水溶液（含0.1mol/L MnSO45ml）冲洗后，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均在48小时内生长，枯草芽孢菌和生孢梭菌仍未生长，表明本品的抑菌作用仍未消除，还需进一步加大冲洗液用量。2.6方法验证试验 取一次性全封闭集菌培养器（

17、两联）一套，取少量冲洗液润湿滤膜，先将2.2项下的样品按薄膜过滤法滤至一管中，用0.1%蛋白胨水溶液（含0.1mol/L MnSO45ml）冲洗，分10次冲洗，每次100ml，并于最后一次冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤，加入100ml相应的培养基于滤筒内作为试验管；另一管加入相应的试验菌及培养基作为对照管。再取硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基分别泵入另两管一次性全封闭集菌培养器中，作为阴性对照管。按规定温度将上述一次性集菌培养器培养35天（硫乙醇酸盐流体培养基置3035培养，改良马丁培养基置2328培养）。各试验菌同法操作，结果见表2.6。表2.6 方法验证试验试验结果金黄色葡

18、萄球菌试验 对照铜绿假单胞菌试验 对照枯草芽孢杆菌试验 对照生孢梭菌试验 对照白色念珠菌试验 对照黑曲霉菌试验 对照阴S G 注：S表示硫乙醇酸盐流体培养基G表示改良马丁培养基。经每管用500ml0.1%蛋白胨水溶液（含0.1mol/L MnSO45ml）冲洗后，枯草芽孢菌在48小时内生长，生孢梭菌在72小时内才被观察到。结果表明，检验条件下生孢梭菌对氟罗沙星注射液更为敏感，所以选择生孢梭菌作为氟罗沙星注射液无菌检查的阳性对照菌。2.7样品的无菌检查取样品60支，分别按薄膜过滤法滤至一次性全封闭集菌培养器（三联）中，每7管滤20支样品，用0.1%蛋白胨水溶液作为冲洗液，冲洗量1000ml/管 ，冲毕，于两管中泵入硫乙醇酸盐流体培养基（其中一管加入小于100cfu的生孢梭菌作为阳性对照管），另一管泵入改良马丁培养基，上述各管按规定温度培养14天，逐日观察，供试品管均澄清，阳性管生长良好，判供试品符合规定。结论方法验证试验表明本品在未冲