肼杂质限度论证及控制策略研究—以水合肼用于药物合成工艺实际运作为例

1、摘要为了将化学合成类新药的安全风险控制在可接受状态，进行杂质遗传毒性评估 判断十分重要。遗传毒性杂质极低的限度要求，对工艺和检测分析提出了更高的挑 战，也成为药品进入欧美市场的技术挑战和潜在壁垒。国内目前合成类首创新药相 对较少，若是合成药产业继续发展首创新药的比例提高，监管机构将来可能会有这 方面关注与考量。设定遗传毒性杂质的可接受限度，需考虑研发所处的阶段，包括 风险管理，适当的检测仪器与技艺精湛的检验人员，对杂质的认识和对工艺的理解， 熟悉相应的法规与指南。本论文以肼杂质为例，检索文献数据，对杂质认识评估归类，运用风险管理工 具，确定其可接受限度。遗传毒性物质分两种情况：一种情况是无法获

2、得试验数据 支持某一阈值的，通常基于风险的 TTC（毒理学关注阈值）；另一种情况是已有文献 试验数据阈值支持某一限度的。第二种情况表明细胞自身保护机制能起作用，遗传 毒性风险相对要小，允许摄入的限度通常比 TTC 更高。若是出现推算结果比 TTC 更 低的情况，需理解这些数据的含义，结合其它领域的信息，论证应用 TTC 限度的合 理性。通过分析归纳总结，肼杂质按 TTC 控制可满足要求。再基于药品最大日剂量以 及具体生产工艺，明确风险控制限度目标，确定控制策略。为选取合适的合成工艺， 识别关键质量属性、确定关键工艺参数，规避或控制遗传毒性杂质方面的风险提供 参考。关键词: 遗传毒性；肼杂质；可

3、接受限度；毒理学关注阈值（TTC）Study on the Control Strategies and Justification for the Acceptance Limits of Hydrazines in Active Pharmaceutical Ingredients- Hydrazine Hydrate Used in Synthetic Process as Perspective In order to assess and control the safety risk of new chemically synthesized drugs, it is very c

4、ritical to investigate and determine the potential genotoxic impurities, which will require the well-controlled manufacture process and well-developed analytical methodologies to support. Evaluation and investigation of potential genotoxic impurities is becoming a critical technical challenge and po

5、tential barrier for new drugs entering into the US and EU regulatory drug markets. Almost all of the chemically synthesized drugs marketed in China had also been approved by EU and/or US and marketed for many years and been proved to be safe, and SFDA has not paid too much effort/attention to this t

6、opic over those approved drugs. How to set up an appropriate genetoxic impurity acceptance limit during the drug development phase requires all the considerations related to drug development, including risk control concept, adequate equipments, skilful analysts, understanding the regulation and guid

7、elines, investigating and evaluating the impurity itself, full knowledge to the manufacture process.In this article, the genotoxic hydrazines is used as an example to demonstrate and discuss how to classify, quality control and set up an acceptable limit. There are two considerable situations in dea

8、ling with genotoxic compounds: one is without sufficient (experimental) evidence for a threshold-related mechanism; another is the genotoxic compounds with sufficient (experimental) evidence for a threshold-related mechanism. Usually, a Threshold of Toxicological Concern (TTC) is established for the

9、 first situation, and a permissible daily exposure (PDE) is calculated from the no observable effects limit (NOEL) or the lowest observed effect level (LOEL) for the second situation. If a higher than TTC acceptance limit level could be supported by the NOEL or LOEL data, then this acceptance limit

10、is considered to be well justified and acceptable. If a higher limit could39not be supported by NOEL or LOEL, then, additional information should be provided to justify whether the impurity can be controlled by TTC.In general, controlling the individual hydrazines impurity by TTC limit is acceptable

11、. And then based upon the TTC limit and the max daily dosage, it is very important to design and develop the process and studying the relationship of the genotoxic impurity control during the choice of synthesis route. All of these works will provide important information to establish the analytical

12、 procedures and determine the genotoxic impurities control strategy.Keywords: Genotoxicity, Hydrazines, Acceptance Criteria Limit, Threshold of Toxicological Concern (TTC)目 录第 1 章 前言5第 2 章 综述及背景介绍82.1杂质的概念及相关指南82.2选题背景92.3研究的意义10第 3 章 杂质风险评估流程12第 4 章 杂质结构评估与归类144.1杂质结构毒性风险归类144.2肼结构杂质归类18第 5 章 肼物质现行

13、认可限度205.1药典现有产品的检索205.2肼的允许暴露量205.3分析检测方法21第 6 章 其它途径摄入肼的允许限度276.1工作场所空气中的肼276.2呼吸途径日摄入量27第 7 章 肼杂质可接受限度及控制策略297.1肼物质的毒性实验文献数据297.2风险工具及风险因素分析307.3控制策略确定32第 8 章 分析局限与结论348.1分析局限348.2结论34第 1 章 前言研究背景: 风险是现代世界的现实的基础，损害健康的风险等于物质毒性与暴露 量的乘积1。近年来，质量源于设计(QbD, Quality by Design)方法在欧美的推广，以 及风险评估管理概念的引入，使得医药工

14、业界对新药品中杂质的遗传毒性关注与控 制得以实现。对遗传毒性杂质来讲，有些物质在与 DNA 直接结合前就失去毒性，有 些在很低的暴露量就可能与 DNA 直接作用产生严重的后果，即使通过动物实验也很 难获得一个确定的阈值。基于整个广泛接受的生命周期较为保守的致癌风险增加概 率（10-5）提出了毒理学关注阈值（TTC, Threshold of Toxicological Concern）。根据 这一风险工具控制的限度，针对人体致癌可能性未知的杂质，按假定 70 年的生命期， 其致癌概率为十万分之一。但对那些强致癌性遗传毒性高度关注的物质，TTC 是不 适用的，必须要尽最大可能避免引入。而对于只是

15、具有警示结构（structural alerts）， 并且该结构是与药品本身结构相关的杂质，因药品本身结构在研发时已经充分的进 行了安全性的评估，这类杂质可按普通杂质控制，没有必要采用 TTC 进行控制2。 因此，对于有潜在遗传毒性的杂质，需要依据化合物的结构-毒性相关性关系，按结 构与毒性分类，然后按照类别，确定其不同的控制方式。针对合成类小分子药物， 进行杂质遗传毒性方面的评估判断，是企业选取工艺路线，控制产品风险的需要， 也是进入欧美药政市场的技术要求之一。研究目的: 本文以肼杂质为例，结合毒性研究数据，初步确定在结构-毒性相关 性分类中的类别，结合行业针对特定杂质的监管限度， 药品的最

16、大日剂量以及用药 期限，进一步确定最大允许的日摄入量，保证特定杂质的风险得到控制，使药品的 安全满足患者的需求，满足监管技术标准的要求。肼杂质的联氨结构（NH2-NH2） 是警示结构，具有潜在的遗传毒性，例如常见的水合肼，欧洲化学品署（ECHA）公 布的注册信息体现，欧洲每年的消耗量在 1 万吨到 10 万吨，其中很大一部分用作制 药原料，在合成氨基脲、异烟肼、呋喃西林、百生肼等原料药的工艺中会出现肼结 构的原料或中间体，形成潜在的肼结构杂质。肼杂质在合成反应过程中也可由医药 中间体二苯甲酮腙等物质而生成。针对可能存在肼杂质的药品，为控制药品的遗传 毒性风险，肼杂质的残留量需要检测，其可接受的

17、限度需要论证。在此以肼杂质为 例，研究其杂质遗传毒性的评估方法以及设定可接受限度，以此作为确定控制产品中遗传毒性杂质水平尺度的一个参考。从而有针对性地选取检测方法，评估所设计 的工艺对特定杂质的去除能力，采取合适的控制策略，保证药品的遗传毒性风险在 可接受 的 范围内 ， 以符合 监 管部门 的 要求和 考 量 。 USFDA(US Food and Drug Administration)以及 EMA(European Medicines Agency)的指南文件都为如何控制新药 中遗传毒性杂质提供了风险评估的工具。具体应用时需理解这一风险评估工具的适 用范围，检索收集分析处理所评估杂质毒性

18、安全性方面尽可能详细的信息，决定是 否采用该风险工具来评估工艺对杂质的去除能力。文献对比评估、计算机辅助评估 符合特定的条件时，绝大多数杂质不需耗费资源用来进行 Ames 实验（细菌突变实 验），更不必针对杂质进行动物体内、体外试验。研究方法: 首先通过搜集文献和总结分析关于肼杂质的毒性研究数据，演算推导 出一个允许的日接触量。再检索获取行业监管部门现行的可接受水平，进一步掌握 其它途径可能摄入肼杂质的允许限度。运用归纳对比以及风险评估控制的手段，确 定按 TTC（毒理学关注阈值）设定肼杂质的可接受限度是否合适，进一步根据检测 评估结果以及具体的工艺步骤，确定合适的控制策略，为分析方法研发以及

19、工艺设 计控制肼杂质提出对策与建议。研究结果: 根据文献总结的毒性数据，结合行业现行监管可接受水平，以及其它 途径允 许 摄入量 ， 归纳总 结 ，肼结构杂质具备动物体内的试验 阈 值（NOEL ， No-observed-effect level）文献数据，体内不与 DNA 直接作用，没有人体强致癌毒性 的报道，可以归为五类中的第二类，杂质分子结构中肼结构以外没有其它警示结构 并存的情况下，风险评估角度提出的 TTC（毒理学关注阈值）适用于肼杂质的控制。 进一步按产品中肼杂质残留评估结果以及工艺对杂质去除能力的大小，相应地采取 日常检测，或者多批检测后的定期检测，甚至在多批检测符合规定后不订

20、入放行规 格的三种控制策略。研究结论: 从最早针对药品纯度的控制，发展到针对杂质系统分析控制，以及近 年来针对新申报小分子药品，遵循风险评估来对遗传毒性杂质极低限度的控制，所 有这些的改变对新研发的生产工艺以及分析检测方法逐渐提出了更高要求。制药业不断发展，对遗传毒性风险杂质的关注度也会发展提高，生产者在确定工艺的过程 中，需要从风险控制角度出发，列出所有可能的潜在杂质，再依据杂质结构识别出 具有遗传毒性警示结构的杂质。进一步了解其毒性数据，针对既有人体强致癌毒性 又有遗传毒性的杂质，通常需要靠改变工艺去避免。确定只具有遗传毒性的杂质， 需要确定其具体可接受限度，建立与监控水平相匹配的检测方法

21、。与此相关的文献、 药典以及其它现有行业标准，基于结构-毒性相关理论的计算机辅助软件，以及毒理 毒性方面的文献数据，可加以引用来加强对杂质的了解和认识，最终决定是否采用 USFDA 和 EMA 指南中基于风险给出的遗传毒性杂质日允许摄入量 TTC（毒理学关 注阈值），生产工艺上来控制并结合检测评估，判断工艺对遗传毒性杂质的去除能力， 根据其产生的步骤和带入成品中可能性大小，来确定采取合适的策略，使杂质的风 险处于可控的状态。基于研究评估结果，水合肼应用到合成工艺中，可以参照 TTC 来进行成品中肼杂质的控制，从结构-毒性相关性理论，结构类似的物质，毒性数据 可以相互引用。只具有肼基团警示结构的

22、杂质，都可以参照 TTC 来进行控制。新药 或新合成路线生产获得的药品，其潜在的遗传毒性杂质可以采用类似的方式进行评 估。所有这一切的目的是保证患者的安全，以及满足监管部门的技术标准和对于遗 传毒性杂质的可接受风险考量的要求。第 2 章 综述及背景介绍2.1 杂质的概念及相关指南杂质限度论证的一般概念在原料药 ICH 指南（Q3A，新原料药中的杂质指南)， 或制剂 ICH 指南（Q3B，新药品中的杂质指南）中进行了详细的描述，杂质具有导 致副作用的潜在可能性，对病人的安全具有潜在的毒性风险，起始物料、中间体、 试剂、溶剂和催化剂都是潜在杂质的来源。在 Q3A-C 中对限度合理性的论证被理解 为

23、是获取与评估限度的过程，被评估的杂质在这个限度上是能保证病人安全的。但 是如果该杂质具有潜在的遗传毒性，确定其可接受限度是一个十分关键的问题，关 于这个问题，欧洲 EMA3和美国 USFDA4的监管部门都已经有相关的指南为制药界 提供了一些解决问题的思路和方法，ICH 在 2013 年初发布了关于遗传毒性杂质的指 南草案 M7，提出了一些更切合实际的途径来解决遗传毒性杂质问题。不仅针对新药，对于改变工艺或者已上市药品进行新的申请，通常也需要按照目 前指南提倡的方法进行遗传毒性杂质的评估研究。不过从仿制的角度，如果对其合 成路线、工艺过程的控制以及所有杂质的概况进行了评价，并且与市场上已经授权

24、销售的同种药物相比较，没有引入新的或更高水平的杂质，评估后或许能支持一个 稍高的限度，但评估工作仍需要进行。对于那些已经授权销售的药品，如果认识到 新的风险，有时也需要再进行遗传毒性杂质方面的评估，比如 2007 年，EU 官方曾 因为药品中甲磺酸和残留乙醇形成遗传毒性杂质甲磺酸乙酯，要求 Roche 公司进行 毒性试验来更好地评估使用过奈非那韦（Viracept）药品的病人的风险5。企业在这 方面主动引起足够的重视，具备一个清晰的策略来控制或规避这方面的风险是十分 重要的。遗传毒性杂质，主要是指以 DNA 反应物为主要研究对象的体外（in vitro）或/ 和活体内（in vivo）的试验中

25、，若是发现某物质对 DNA 有潜在的破坏性，就可以称 之为有潜在的遗传毒性。若是有足够的后续试验数据来证明体外体内实验的相关性， 体外的试验结果可以用作对活体内的遗传毒性的关联性进行评估的间接手段。当缺 乏后续试验数据的时候，若体外实验结果显示遗传毒性的物质，经常被认定为体内 诱变剂和致癌剂。基于结构-毒性相关性理论，具有某一相同警示结构的化合物，往 往其毒性数据可以相互参考，因此可将遗传毒性杂质按结构分类来对待。2.2 选题背景出于对患者的安全以及药政监管要求考虑，遗传毒性杂质的控制已经是新开发合 成类小分子药品生产工艺设计过程中不可回避的课题，EDQM 近年列出的评审问题 前十排行中，每年

26、都已经有这个话题的出现，监管机构或行业协会对制药工业界的 法规性指南也为进行这方面的研究提供了相关的依据。企业结合具体情况，组织内 外的资源，对药品中理论上可能存在的以及确实存在的遗传毒性杂质作出评估，认 识风险，制定合适的质控策略，切合实际地加以控制相关的遗传毒性杂质，才能既 满足监管的技术标准，又避免过多的检测，确保企业有限的资源集中到对患者安全 高度相关的关键性的工作中，确保药品的安全与质量风险处于可接受的状态，并确 保企业研发时间及费用的可控性，保证产品研发上市的速度。欧美一些创新药生产企业，在这方面已经开展过不少研究评估，具备较为完善的 数据库以及应对措施和方案。默克药厂的 Gana

27、pathy Mohan 博士在 2009 年的一次讲 座课件中6，列出过一些欧美官方关于遗传毒性风险杂质反馈意见的例子：问题 1） 合理性说明原料药符合 CPMP/SWP/8199/02, EMEA/CHMP/QWP/251344/2006 关于遗 传毒性杂质限度的指南（匈牙利）。问题 2）提供关于潜在遗传毒性结构的讨论来说 明在生产工艺中可能产生并带入最后原料药中的可能性（西班牙）；问题 3）甲磺酸， 甲醇，乙醇在起始物料的工艺中经常使用到，请提供免除对该来料或原料药进行甲 磺酸甲酯和甲磺酸乙酯检测的理由(美国)；问题 4）提供临床试验用原料药批次关于 潜在遗传毒性杂质降解物的实际水平；杂质

28、的结构显示有两个警示结构（, 不饱 和酮），最大的日剂量 11mg/天，RRT1.05 的杂质不超过 60g/天，当按 800mg/天的 日剂量时，这个杂质的日摄入量为 4,320g/天（美国）；问题 5）甲磺酸乙酯和甲磺 酸异丙酯是遗传毒性杂质，应该在原料药中设定规格并加以控制。同时应该提供验 证过的检测方法。在起始物料新的合成路线中，“苯甲基肼盐”的肼被用到，它是一 个遗传毒性杂质，应该在原料药或者起始物料的规格中列出并加以控制，应提供验 证过的分析方法（美国）。药政官方目前所关注的主要集中在以下几方面：1）对遗 传毒性杂质指南的确认；2）所采用合成路线条件下的潜在杂质；3）对原料/试剂的

29、 筛选；4）对所设定限度的合理性说明。本文选取一个方面，基于结构-毒性相关性 归类理论，通过检索，分析并归纳总结，对所设定肼的限度的合理性进行论证。2.3 研究的意义ICH 指南 Q3A 提到，针对新药中毒性异常高的杂质，需按更低的限度，比如遗 传毒性杂质，以确保病人的安全。从 2006 年开始，制药业界就开始关注杂质的遗传毒性。EMEA 在 2007 年 1 月发布指南，2008 年 2 月要求评估所有已经上市的药品中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，2008 年 6 月和 2009 年 12 月，以问答的形式对指南进行解读。USFDA 在 2008 年 12 月发布的指南草案，也为对待原料药和药品

30、中遗传毒 性杂质提供了参考。ICH 也已经就这一话题发布了 M7 指南草案。针对新申报的小分 子合成类药品，欧美药监机构在遗传毒性杂质方面的期望也在不断地提高。随着原 创小分子新药或新合成工艺的出现，不远的将来我国的监管机构可能也会将潜在遗 传毒性杂质的研究评估作为原创小分子药品安全性方面的要求。因为这是监控安全 风险的需要，也是通过合理提高技术标准来抑制恶性竞争的方向之一。遗传毒性杂质的评估，针对新申报的药品，2006 年就由欧洲单个国家药政评审 开始陆续提出，官方的评审反馈信中也体现，识别和评估杂质遗传毒性的方法有基 于结构-毒性相关理论的计算机辅助软件，Ames 试验(致突变性检测)，动

31、物体外、 体内实验。通过对 TTC（毒理学关注阈值）工具背景的了解，针对没有毒性数据的 遗传毒性杂质，根据其结构判断并检索是否有确定的人体强致癌性，排除第一类高 度关注致癌物杂质的可能，即可采用此风险工具来进行控制，而不需针对杂质进行 体内、体外实验。仿制药合成工艺，通常来源于原创药厂商过期工艺专利，合成路 线不会有大的变化，作为潜在杂质的中间体，其遗传毒性的风险相对会低一些， 但 也是需要关注的。制药企业通常不会也没有必要进行巨额花费来对杂质进行动物实 验，研究如何利用好现有的数据以及工业界普遍接受认可的标准及方法，对杂质进 行认识了解，按遗传毒性风险进行归类，确定其可接受的限度是十分重要的

32、。针对 新申报药品或者修改工艺重新申报的药品，从遗传毒性杂质评估方面提出了以下相 关的考量：在产品工艺设计阶段和质量评估阶段，如何更有效地侧重于满足药政评 审及确保病人用药安全要求、同时考虑到合成工艺和药物分析耗费负担增加，以及 新药上市速度可能的延缓，能否在这三者之间找到一个平衡，都具有一定的参考价 值。同时就生产工艺，毒理学关注限度和分析方法方面为出发点，如何与质量控制 和药监药政方面顺利地完成遗传毒性杂质的评估提出一些设想。在新药的研发阶段 和上市过程中都考虑控制遗传毒性杂质是非常关键的，因为有许多影响因素（比如分析方法方面的稳健性等），研发早期开发分析方法来控制遗传毒性杂质是一项十分

33、具有挑战性的工作，指南文件就临床阶段不同的给药期限给出了不同的允许限度。以结构-毒性相关性方面为出发点，从遗传毒性风险角度，制药界已经广泛接受 将杂质分为五类并采取不同的对待方式：1）针对第一类，强致癌性的遗传毒性杂质， TTC（毒理学关注阈值）是不适用的。往往通过工艺上避免、原材料控制来规避这 类风险，要避免应用到制药工艺中去；2）第二类遗传毒性杂质，有遗传毒性的风险， 没有人体强致癌毒性报道，往往原料带入或工艺过程中产生，除了需要尽量限制引 入，生产工艺中做好控制并进行评估也是可能的对待方式，TTC 风险工具是适用的； 3）第三类杂质，具有警示结构，遗传毒性和人体致癌性都未知，需要考虑从工

34、艺上 去控制，直接采用 TTC 控制或进一步评估确认，通过细菌突变实验，判断其作为第 二类或者按第五类普通类杂质来对待；4）第四类与第五类杂质，现有 ICH 指南 Q3A-C 能够进行指导控制。遗传毒性杂质工艺上考虑，需避免有第一类人体强致癌物的直接引入，作为原料 中杂质的间接来源，其可能性也需要基于当前的知识进行评估；第二类与第三类杂 质，具有遗传毒性风险，没有人体强致癌性的报道，是遗传毒性杂质指南法规文件 所重点研究和关注的，也是合成类小分子新药或应用新工艺时所需要重点具体控制 的，从工艺上考虑予以去除，选取或开发足够灵敏的方法来进行评估，并确定控制 策略；针对新上市的药品中牵涉到的以上各

35、类杂质，有一个清晰的策略来为满足全 球药政市场的要求做积极准备是十分重要的。第 3 章 杂质风险评估流程整个评估流程以针对假定的和/或已知的杂质，以对合成路线的评估开始，接着 是对已经认为可能存在的杂质进行结构上的评估，若有可能，和其它合成路线的原 料与试剂一起进行评估，危害分类，量化和/或安全测试，风险评估并最终选定合成 路线，根据需要，建立检测方法并确定控制策略。在 USFDA 以及 EMA 所发布的遗传毒性杂质相关指南基础上，结合英国阿斯利 康药厂的 Charles Humfrey 博士所公开的讲义7，现将基本的评估流程以图 3.1 的方 式呈现如下。这只是一个基本的流程，实际应用的过程

36、中应该是弹性灵活的。每一 种原料药的合成都有它自身的特色，所描述的步骤的顺序可能会改变，但总体的程 序应该保持大致相同。识别原料药和制剂中的潜在杂质（包括起始物料，中间 体，试剂，明显的副产物，降解物等可能的来源）进行结构活性相关性评估（DEREK，Mcase）杂质评估与归类（是否具有警示结构？）风险控制工具适用性判断对 API 中杂质的限度水平进行论证沟通交流达成控制策略图 3.1 遗传毒性杂质风险评估基本流程图 遗传毒性杂质的风险评估与允许的限度之间有一个清晰的关系。任何这类评估应该将该药物的研发所处的阶段、计划的剂量、临床实验可能的时间期限考虑在内。 可接受的限度是基于 EMA 的“分层

37、级 TTC 理论(staged TTC)”，从临床试验到上市药 品，根据不同的给药期限，分成 6 个层级。前面提到 EMA 参考指南问答稿3，将日 剂量，给药期限已经都考虑在内，以杂质的日允许摄入量除以药品的日剂量，得出的对应限度关系，列入下面的表 3.1。表 3.1-分层级 TTC, 日剂量以及遗传毒性杂质限度之间的关系给药期限（月）日摄入量（g/天）基于日剂量的杂质限度（ppm）1mg2.5mg5mg10mg50mg0.1g0.2g0.5g1.0g2.0g>121.5150060030015030157.531.50.7512550002000100050010050251052.5

38、6105000400020001000200100502010532050005000400020004002001004020101605000500050005000120060030012060301412050005000500050002400120060024012060从换算来的表格中的数据可以看出，针对毒性异常的杂质，长期和剂量较高的情 况下，很多限度要求都低于了 ICH Q3A 所要求进行安全性评估的限度 1500ppm。ICH 指南 Q3A 不能充分地覆盖这些情况，这就是 TTC 风险工具所要进行控制的。最近，ICH 发布的 M7 指南草案，基于 Haber 理论，即毒物学

39、的基本理论：浓度（c）与时间（t）的乘积是一个常数（k），也给出了不同给药期限下的允许暴露量， 将为临床实验和不同的给药期限提供了一个参考的限度，不仅考虑了单个遗传毒性 杂质，对总遗传毒性杂质的限度也提出了要求，列出见下面的表 3.2，ICH 指南 M7 草案对短期用药的情况进行了微调，并予以补充和完善，将来推广后，将为新药临 床实验或短期用药参考，也为同时出现多个遗传毒性杂质的情况提供了参考依据。表 3.2 不同给药期限下单个遗传毒性杂质 TTC 和总遗传毒性杂质 TTC 的关系给药期限不长于 1 个月1 个月到 12 个月1 年到 10 年10 年以上单个遗传毒性杂质日摄入量（g/天）12

40、020101.5总遗传毒性杂质日摄入量（g/天）1206010（30*）5*临床研究 3 年以上，相似的原则在论证的情况下可能可以应用到市售的药品。表 3.2 明确给出了官方现阶段的想法，在合理论证后，比 TTC（毒理学关注阈值） 更高的限度也是可以接受的，比如短期治疗用药，用于威胁生命的疾病的治疗，晚 期疾病的治疗。第 4 章 杂质结构评估与归类4.1 杂质结构毒性风险归类依据图 3.1 的基本流程，实际评估过程中主要包括杂质的识别、分类、限度论证、 生产工艺控制及成品检测的内容，主要的步骤如下：1）工艺人员评估合成路线来识 别具有警示结构的化合物，清单包括起始物料、中间体、试剂、明显的副产

41、物，初 步简单地寻找警示结构，不是进行分子结构-毒性相关性评估。2）工艺人员和分析 人员修改最初的清单，基于工艺评估该杂质被带入药品中的可能性，并结合具体的 分析检测数据。 3）毒性研究人员针对重点化合物进行分子结构-毒性相关性安全评 估，针对已知的、理论上可能出现的潜在遗传毒性杂质，依据参考文献或毒性实验 数据，进行归类来设定限度。4）根据多批评估结果和工艺具体情况来判断带入成品 中的可能性大小，确定检测控制策略。当工艺人员确定生产工艺中出现警示结构时，需要多方参与对比判断评估。例如， 若出现肼结构杂质，首先工艺人员需确认是否有可替代的合成路线来避免这类物质。 再基于文献或实验数据的结果，来

42、确定这类杂质的可接受限度，进一步从工艺反应 机理和分析检测评估两方面来组织对这类杂质出现在成品中的可能性进行评估，确 定合适的控制策略。从工艺上分析在原料药中出现的可能性，比如一个遗传毒性肼结构的起始物料在 五步反应的第一步用到，不太可能带入原料药中，但也需要检测评估证实。另外遗 传毒性物质也可能在后续的步骤被破坏或者去除。需要分析数据来证实遗传毒性杂 质在最后产物中出现的可能性。但由于现有的分析方法，尤其是早期的实验方法的 灵敏度，可能不足以灵敏精确地检测到 TTC（毒理学关注阈值）水平以下的杂质， 分析人员研发相应的实验分析方法所作的努力十分重要。评估是否具有警示结构， 药品研发过程中，

43、需要借助数据库 NTP（National Toxicology Program）所收录的警 示结构或者相应的计算机辅助软件来评估确定。在 NTP 所收录的警示结构库中，肼结构的杂质已经列为警示结构，遗传毒性杂 质的毒理学评估和这些杂质在活性药物中的可接受标准的确定是一件困难的事情， 在现有的 ICH 指南 Q3AC 中也没有详细的规定。遗传毒性物质在任何摄入量都对 DNA 有潜在破坏性，这样的破坏也有可能会导致产生肿瘤的相关变异。 然而，对 于遗传毒性的致癌物，“不存在明显的阀值，或者说在任何摄入量的水平都有致癌风险”的说法不能接受。生物学上重要的“阀值理论”也可以应用在遗传毒性的研究上， 这

44、观点已经正在被逐渐的认可，并被 USFDA、EMA 和 ICH 的遗传毒性相关指南文 件所采用。有的化合物，比如叠氮钠、水合肼，它们可与非 DNA 靶点进行结合反应， 或者说有一些可能致突变的物质，比如亚硝酸盐，在与关键靶位结合之前就已经迅 速地失去了毒性，对这种性质的化合物，可以鉴定其 NOEL（No-observed-effect level, 不可观察到效果的最低水平）和 UF（Uncertainty factors, 不确定因子）来推算允许 的安全的摄入量。 对于那些可能直接与 DNA 结合反应的物质，比如一些烷基化试 剂，按摄入量由高到低所造成的影响程度（潜在可能的导致肿瘤的活性）进

45、行线性 推断是很困难的，因为在较低的摄入量时，宿主细胞自身基因免受损害的修复机制 可以有效的运行。对于一个特定的诱变剂，很难从实验方面证明它的遗传毒性存在 一个阀值。由于缺乏支持遗传毒性阀值存在的有力证据，而使得我们很难界定一个 安全的服用量，所以有必要采取前面提到的一个新观点：使用了从一个半数致癌剂 量（TD50）到百万分之一的致癌剂量的线性推理， 确定一个可接受其风险的摄入量 TTC 来作为风险控制工具。尽管 ICH 指南 Q3A（R）和 Q3B（R）指出，检测限度之下的杂质不需要鉴别， 但应该为那些效力异常，在检测限度之下也有可能产生毒性或药理学作用的潜在杂 质开发分析方法，其目的是为了

46、控制这些毒性异常杂质的风险。指南推荐从整个合 成路线来评估，包括化学反应和条件，识别试剂、中间体、起始物料和可以预知的 潜在副产物。识别出这些潜在遗传毒性杂质后，就由专业人员针对列出的物质，采 用计算机辅助工具比如 QSAR 或知识库专家系统进行遗传毒性初步评估。也可通过 文献和内部档案检索来完成，因为一些中间体和试剂在其他的药物研发中已经被当 成遗传毒性杂质进行实验，实验数据比计算机预测的要可信，化合物的理化性质以 及在人体内表现出的活性，直接由化合物的结构所决定，因此依据杂质的结构，可 以将杂质遗传毒性的大小实行归类。这与行业现行的通过毒性风险大小将有机溶剂 分为四类，将重金属分为三类的做

47、法是相类似的，都是将受高度关注毒性最大的物 质归为第一类。原料药中的杂质，包括肼类杂质，都可以根据现有的信息，归为五 类中的某一类。目的是为了将风险进行分级而采取不同的控制策略。五种类型的杂 质以及可能的对待方式已经有学者归纳总结过8，列出详见下面的表 4-1。表 4-1杂质遗传毒性评估结构分类类别结构特征可能的对待方式第一类具有遗传毒性和致癌性，这最好的选择是通过改变合成路线，改变起始类杂质包括已知的可使动物料或增加去除步骤来避免药品中出现这类物致癌的物质，具有足够的杂质，尽管在几乎已经优化的工艺上做根本关于遗传毒性和人类致癌的改变是不可行的，规格中通常应该予以检的数据。如：氧化偶氮基化测。

48、当获得足够两年的啮齿类动物毒性实验合物，N-亚硝基化合物。数据时，能够进行化合物特定的风险计算。TD50（半数中毒量）或者 MTD（最大耐受剂量）能够被用来计算最大的日摄入量。第二类具有遗传毒性，但致癌作用应该评估它是否表现出有一个动物实验阈尚未知的杂质，包括那些在值。如果不与 DNA 直接作用，人体允许暴露可靠的遗传毒性实验中呈限度能够通过确定 NOEL(不可观察到效果的阳性，但致癌作用未知的杂最低水平)或者 LOEL(可观察到效果的最低质。肼结构杂质评估后归为水平)的值来确定。 当杂质与 DNA 直接作用该类。（比如，DNA 加合物形成或与 DNA 结合），它们的限度将采用 TTC（毒理学

49、关注阈值）来进行控制。第三类具有警示结构，与原料药的这类杂质含有警示结构，却没有试验数据。结构不相关，不确定是否具一个第三类杂质可能会需要采取下面的措有遗传毒性或致癌作用。施：(1)通过 Ames 试验来测试单独分离的杂质，或通过在原料药中加入杂质，对混合物进行 Ames 试验；进一步进行归类，阳性结果归为第二类，阴性结果归为第五类。(2)有效检测 API 中杂质到 ppm 的水平；(3)如果可能，提供化学上的分析来证明杂质不会被带入到原料药中（比如，在接下来的反应条件下不稳定而降解）。第四类警示结构，与原料药本身相虽然杂质本身的遗传毒性未知，原料药的遗关，这类杂质包括有与原料传毒性已经系统地

50、研究过，因此不需要针对药共有的结构。杂质进行这方面的研究。第五类无化学结构警示或有充分的数据证明无遗传毒性。作为常规杂质，参照 ICH Q3A 进行控制以上五类杂质，第一类需要特殊对待除外，其它四类会根据对风险的认识程度与 遗传毒性风险的大小，表述成如下的决策树，视情况可以进一步分为三种方式进行 限度的论证，不同种类的结构经过一系列评估确认之后， 根据其毒性风险的大小， 采用三种方式评估确定不同的可接受限度。第一类：具有遗 传毒性和致癌性第三类：具有 API 结构 不相关的警示结构第五类：没有警 示结构去除杂 质？第二类：具有遗传 毒性致癌性未知是或没检测遗传毒 性？1）第四类：具有 API

51、结 构相关的警示结构否阈 值控制风险评 估？3）API 是否遗 传毒性？2）是否否否或未知按 TTC 进行控制PDE，参考 ICH Q3C作为普通杂质控制注释：图 4.3 杂质的分类，验证和风险评估(1) 不管是用纯杂质测试还是加入原料药中进行测试，达到 250g/板(2) 如果原料药是阳性，需要进行风险-益处分析。(3) 定量风险评估来确定 ADI。当杂质的毒性阈值已经具备的情况下，通常会按照 PDE(每日最大摄入量)的方式 进行控制。但有的时候，根据现有的数据，会得到一个比 TTC（毒理学关注阈值） 更低的值。具备动物实验阈值 NOEL（不可观察到效果的最低水平）的物质，在动 物体内与其它

52、的靶点结合失去活性，低摄入量时不直接与 DNA 结合的，其遗传毒性 风险相对与 DNA 直接结合的物质要低，水合肼动物实验的 NOEL 值换算到人体的日 允许暴露量，其计算过程中，除了考虑体重折算，还极其保守地采用了 F1 到 F5 连 相乘得到 5000 的不确定因子（UF，Uncertainty factors），是一个比 TTC 更保守的估 算值，若出现比 TTC 更低的情况，需要理解各个数据背后的含义，基于官方公布的 信息，并借助其它一些信息，来了解该杂质的毒性受关注程度，确认 TTC 是否适用。原料药（API）中发现的遗传毒性杂质或者形成的杂质已知具有遗传毒性，这些 杂质通常是原料所

53、引入，合成工艺中间体或副产物。事实上，这些物质在合成过程 中被利用来作为活性基础部分也体现在它们能够与生物物质反应，包括与 DNA 反应。这些与 DNA 的相互作用认为是基因突变，具有潜在的致癌危险。因此，遗传毒 性杂质近年来成为新药研发过程中高度关注的问题，为了确保病人安全，有效地评 估，尤其是针对新药，控制和监控这些杂质变得十分重要。有不同的方法来评估一 个杂质是否具有遗传毒性，包括从警示结构判断，计算机软件模拟评估（in-silico） 到体内试验，由此所需要的资源花费是呈几何级增长的。随着试验的深入，对杂质 性质了解的深入，风险的不确定性也将逐渐降低。当前的观点是，只要满足特定的 条件

54、，针对药品中绝大多数遗传毒性杂质，进行动物试验，甚至进行细菌突变试验 都是没有必要的。监管机构也认识到了这个问题，为了在患者安全与行业资源花费 之间找到一个平衡点，推荐了一个风险控制工具 TTC（毒理学关注阈值）。除了第一 类高度关注的杂质，绝大多数遗传毒性物质可不进行体外、体内试验，采用 TTC（毒 理学关注阈值）这个风险控制工具就可将遗传毒性杂质的风险控制在接受的范围内。 但应用这个工具的时候，我们既需要了解这个工具的含义，又需要尽可能深入地了 解所要控制杂质的性质。下面主要就 TTC（毒理学关注阈值）工具本身作一些阐述和理解。随着检测仪 器与分析技术的发展提高，灵敏性较高的检测方法得以应

55、用，TTC（毒理学关注阈 值）理论已经在食品，化妆品的行业广泛应用。针对具有遗传毒性警示结构，而无 动物或人体强致癌毒性报道的杂质，若是对其开展深入的动物体内或体外实验，这 将耗费企业、整个行业，以及消费大众的资源，对药品上市进程影响也是巨大的。 监管机构意识到这个问题，基于极低的人体副作用伤害概率，许多化合物的“安全” 暴露水平能够基于它们各自的结构来确定，作为杂质，其遗传毒性由特定的结构片 段来决定，已知的毒性也能够适用于结构类似的化合物。4.2 肼结构杂质归类肼杂质是体外实验显示一定的 DNA-反应活性，动物体内的 NOEL 阈值可以获得， 按其换算出来的人体日暴露量比 TTC 更低，这

56、个需要分析各数据的背景与含义，基 于药政官方公布的信息来确定一个可接受的限度。药政监管机构的意见，可以来源 于注册评审过程中药政监管机构在反馈信中的意见，以及官方对指南文件的解读， 也可以从药典现有的限度水平。其它领域中关于该物质的信息也可以适当地加以了 解。肼杂质具有警示结构，具备水合肼在动物体内试验的结果，没有人体强致癌毒性的报道，肼杂质可以归为五类杂质中的第二类，若是工艺上无法避免，需考虑从 生产工艺过程中进行控制来清除，按 TTC（毒理学关注阈值）进行评估控制。下面 将从现行认可标准，其它途径允许摄入限度， 已经具备的毒理毒性数据三个方面论 证作为第二类杂质的合理性。第 5 章 肼物质现行认可限度5.1 药典现有产品的检索查阅了两个主要发达市场现行的药典法定标准，欧洲药典与美国药典，将建立了 肼杂质检测项目的原料药列入表 5-1 如下。表 5-1 药典专论现行肼的限度药典API（原料药）肼限度（ppm）Ph.Eur别嘌呤醇 Allopurinol2.5USP别嘌呤醇 Allopurinol10Ph. Eur卡比多巴 Carbidopa20Ph. Eur共聚维酮 Copovidone1USP共聚维