毒理学实验基础

1、第四章 毒理学实验基础一、毒理学实验的原则二、毒理学实验的目的三、实验动物的选择和处置四、剂量设置和对照五、结果处理一、毒理学实验的原则1.1. 化学物在实验动物中产生的作用可以外推于人：化学物在实验动物中产生的作用可以外推于人：（1 1）人是最敏感的动物；）人是最敏感的动物；（2 2）人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与）人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重体重或体表面积或体表面积相关。相关。2.2. 实验动物必须暴露于实验动物必须暴露于高剂量高剂量，这是发现对人造成，这是发现对人造成潜在危害的可靠方法。潜在危害的可靠方法。3.3. 成年成年的健康动物和人可能的的健康动物

2、和人可能的暴露途径暴露途径是基本的选是基本的选择。择。毒理学实验的局限性毒理学实验的局限性-动物实验结果外推到人的不确定性动物实验结果外推到人的不确定性1. 动物与人对外源化学物的反应敏感性可能不同，甚至存在质动物与人对外源化学物的反应敏感性可能不同，甚至存在质的差别；的差别；2. 使用少量动物、采用较大剂量，使对群体的代表性较差，可使用少量动物、采用较大剂量，使对群体的代表性较差，可能造成高剂量与低剂量的差异；能造成高剂量与低剂量的差异；3. 动物数量较少，对低概率毒效应难以发现；动物数量较少，对低概率毒效应难以发现；4. 实验动物为纯系，成年动物，反应较单一，与接触人群的复实验动物为纯系，

3、成年动物，反应较单一，与接触人群的复杂性不匹配，对外源化学物的易感性存在差异。杂性不匹配，对外源化学物的易感性存在差异。二、毒理学实验的目的1.1. 受试物毒作用的表现和性质受试物毒作用的表现和性质（描述毒理学）（描述毒理学） 在急性或慢性实验中观察动物异常，发在急性或慢性实验中观察动物异常，发现有害作用现有害作用1.1. 剂量剂量- -反应（效应）研究反应（效应）研究 毒性评价和安全性评价的基础；得到多毒性评价和安全性评价的基础；得到多种毒性参数和剂量种毒性参数和剂量- -反应（效应）线的斜率反应（效应）线的斜率1.1. 确定毒作用的器官确定毒作用的器官 阐明毒作用特点，为机制研究和毒性阐明

4、毒作用特点，为机制研究和毒性防治提供线索防治提供线索1.1. 确定损伤的可逆性确定损伤的可逆性通过动物对外源化学物的毒性反应，向人外推，以期评价化学物对人的危害和危险性三、动物实验的职业道德一般原则 人道主义的管理和处理 使痛觉和不适感减到最小 避免不必要的使用动物3R 原则 replacement替代：用无知觉材料的科学方法替代有知觉脊椎动物的方法 reduction减少：保证数据信息前提下，尽量减少动物使用数量 refinement优化：必须使用动物时，减少非人道程序的影响实验动物：指经人工培育，对其携带微生物实行控制，遗传背景明确，来指经人工培育，对其携带微生物实行控制，遗传背景明确，来

5、源清楚，可用于科学研究的动物。源清楚，可用于科学研究的动物。四、实验动物的选择（一）物种选择基本原则：1.对外源化学物的毒性反应及代谢特点与人类接近的物种（很难满足）；2.自然寿命不太长的物种；3.易于饲养和实验操作的物种；4.经济并易于获得的物种。常规实验选择两个物种，分属：啮齿类非啮齿类 豚鼠：特点是毛短而光滑，生长快，抗病力强，繁殖性能好。广泛用于药物学、传染病学、免疫学、营养学、耳科学等各项医学及生物学的研究中。 C57BL/6J小鼠：黑色，对放射物质耐受性强，但照射后肝癌发生率高。眼畸形，对结核杆菌有耐受性嗜酒精性高，是肿瘤学、生理学、遗传学研究常用品系。 SD大鼠：白色，产仔多，生

6、长发育较Wistar大鼠为快，对疾病的抵抗力尤以呼吸道疾病的抵抗力强。自发肿瘤发生率较低，对性激素感受性高。 Lewise大鼠：近交系大鼠，白化，对诱发自身免疫心肌炎高度敏感，可诱发过敏性脑脊髓炎、过敏性关节炎和自身免疫复合物血管球性肾炎等立刻移植多种肿瘤，高脂肪食物容易引起肥胖症。 BALB/c小鼠：对致癌因子敏感，对放射性照射极为敏感。生产性能良好，繁殖期长，广泛应用于肿瘤学、对致癌因子敏感，对放射性照射极为敏感。生产性能良好，繁殖期长，广泛应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学和单克隆抗体等研究。生理学、免疫学、核医学和单克隆抗体等研究。 BN大鼠：近交系大鼠，棕色，对实验过敏性脑脊髓炎有

7、抗力。近交系大鼠，棕色，对实验过敏性脑脊髓炎有抗力。对自家免疫性复合性肾小球肾炎也具抗力。平均对自家免疫性复合性肾小球肾炎也具抗力。平均3131月龄大鼠心月龄大鼠心内膜疾病的发生率为内膜疾病的发生率为7%7%，先天性高血压为，先天性高血压为30%30%。 长爪沙鼠：被毛棕灰色，对许多需氧及厌氧菌敏感，对多种病毒、寄生虫等敏感，也常用于脑神经病、内分泌学、代谢病、肿瘤学等方面的研究。 品系：指用计划交配的方法获得的起源于共同祖先的一群动物。同一品系的动物具有共同的遗传来源、相似的外貌特征、独特的生物学特性、稳定的遗传性能（二）品系选择（1）近交系动物：指采用连续指采用连续2020代以上兄妹交配或

8、亲子交配而培育的纯品系动物。代以上兄妹交配或亲子交配而培育的纯品系动物。 基因纯合度基因纯合度98.6%98.6%99.8%99.8% 适用于涉及组织或肿瘤移植的实验适用于涉及组织或肿瘤移植的实验. . 津白津白、津白、津白、615615、BALB/cBALB/c、C3HC3H小鼠小鼠突变系动物：动物在生长繁殖过程中，通过自然突变或人工定向突变的方法，使其动物在生长繁殖过程中，通过自然突变或人工定向突变的方法，使其某基因发生突变并丧失原有的正常功能，该突变基因可以世代相传并保持遗传基某基因发生突变并丧失原有的正常功能，该突变基因可以世代相传并保持遗传基因特性的品系动物。因特性的品系动物。无胸腺

9、裸鼠：免疫系统缺陷可接受人类多种癌细胞移植。免疫系统缺陷可接受人类多种癌细胞移植。免疫毒理学、化学致癌作用等研究领域免疫毒理学、化学致癌作用等研究领域(2)杂交群动物：指两个不同近交系之间有目的地进行交配所产生的第一代动物，即指两个不同近交系之间有目的地进行交配所产生的第一代动物，即杂交第一代动物。杂交第一代动物。具两系双亲所有的遗传特性，杂合程度一致，个体差异小；具备杂交优势，生命力具两系双亲所有的遗传特性，杂合程度一致，个体差异小；具备杂交优势，生命力强，无近亲衰退现象。强，无近亲衰退现象。不能继续繁殖育种，因在子二代会发生遗传性状分离。不能继续繁殖育种，因在子二代会发生遗传性状分离。(3

10、)封闭群动物：指在指在5 5年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所保存繁殖的动物群定场所保存繁殖的动物群. . 具有一定程度的遗传学差异具有一定程度的遗传学差异. . 昆明种小鼠、昆明种小鼠、NIHNIH小鼠、小鼠、LACALACA小鼠、小鼠、SDSD大鼠、青紫蓝兔、新西兰兔等均属封大鼠、青紫蓝兔、新西兰兔等均属封闭群动物闭群动物. .动物品系的遗传均一性 遗传均一性排序：近交系杂交群封闭群近交系杂交群封闭群 实验动物选择：适宜品系、固定品系实验动物选择：适宜品系、固定品系无菌动物GF：指体内外均无任何微生物和寄生虫的动物。是经人

11、工剖腹产净化培育。悉生动物GN：已知菌动物，指体内带有已知微生物的动物。经人工有计划地将已知菌投入动物体内。（三）实验动物微生物控制的选择按照微生物控制分类，实验动物分为四级无特定病原体动物SPF：指体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物。来源于GF和GN，饲养于封闭的系统中。 SPF已成为国际上进行毒理学试验的标准实验动物。清洁动物CL：即最低限度无疾病动物，动物体内外不携带人畜共患疾病的病原体或动物传染病病原体。饲养于半屏蔽系统。（四）、个体选择性别：初次试验雌雄同用；存在差异分开统计；选敏感性别。年龄和体重：动物年龄依实验类型选择，取成年期数据。体重可作为判断年龄的指标。生理状态：避免激素

12、影响，雌雄分开饲养；繁殖实验、致畸试验适时合笼交配。健康状况：用健康动物，提前观察确认。（五）实验动物管理 动物管理：动物的接受、适应、饲养、鉴别和记录（动物来源、处理、其它资料）. 环境条件管理：气候（温度、湿度、通风、光照）、其它条件（噪音、气味、垫料、群体密度、空间限制）、饲料、饮水等. 设施管理：清洁卫生、废弃物处理、害虫控制、突发事件管理.五、受试物样品的准备 了解其化学结构与理化性质：挥发性、溶解性、稳定性； 纯度及杂质成分； 采用同一种同一批号受试物; 毒性资料查阅（形似化学物）; 制备成一定剂型：水溶液、油溶液、混悬液.一、体内毒理学试验设计剂量分组以获得剂量以获得剂量- -反

13、应关系，确认受试反应关系，确认受试物与毒作用的关系物与毒作用的关系：至少三个剂量组（高、至少三个剂量组（高、中、低）；设对照组（阳性、阴性、未处理中、低）；设对照组（阳性、阴性、未处理对照、历史性对照）对照、历史性对照）各组动物数：实验目的和设计、统计学要求试验期限：由实验目的和所用动物种或品系由实验目的和所用动物种或品系决定：决定：急毒为一次或急毒为一次或24h24h内多次染毒观察内多次染毒观察1414天，天，亚慢性规定持续至动物寿命的亚慢性规定持续至动物寿命的10%10%，慢性实验、，慢性实验、致癌实验为持续至动物寿命的大部分。致癌实验为持续至动物寿命的大部分。六、毒理学实验设计要点二、体

14、外毒理学试验设计 溶解性测试：在实验测试期间，受试物溶解性可能改变，起始和结束时评价溶解性具有意义； 最高剂量推荐：高剂量会影响渗透压引发损伤，上限为：动物细胞10mmol/L或5mg/ml;细菌实验5mg/平板。毒性物应有毒效应和致死率。 代谢活化：大鼠预处理后，取肝组织匀浆为代谢活化系统-S9（p124） 阳性对照：剂量反应的直线部分 重复：可疑结果要重复，但非简单重复六、毒理学实验设计要点七、实验动物染毒和处置 尽可能模拟人接触毒物的方式 不同途径的吸收速率为：静注吸入 肌注 腹腔注射 皮下注射 经口 皮内注射 其他一、染毒 经口染毒：（1）喂饲、（2）灌胃、（3）吞咽胶囊； 经呼吸道染

15、毒：（1）静式吸入染毒、（2）动式吸入染毒 经皮肤染毒： 注射染毒：尾静脉、肌注、皮下、腹腔实验动物染毒和处置针对一种外源化学物，如何选择染毒方式?二、生物标本采集 生物标本采集：（1）血液（终末、非终末采血）、（2）尿液采集、（3）胆汁采集、（4）粪便采集. 麻醉：短效、中效、长效麻醉剂使用-；麻醉过程观察. 安死术：p129. 病理解剖和样标本留取：(1(1）大体解剖、（2）组织病理学检测.实验动物染毒和处置八、毒理学实验的统计学基础 统计学要点：实验设计遵循原则：随机、重复、对照.包括：（1）剂量水平数目及间隔；（2）每个剂量点的实验单位数，实验单位确定要保证样本的独立性、代表性；（3）

16、对照设置；（4）非实验因素条件的均一性：样本足够数量、适当重复、盲法观察等。结果统计分析：方法选择，可用不同方法处理.毒理学实验结果评价 结果评价需要解决的问题 是否具有统计学意义 是否具有生物学意义 是否具有毒理学意义具有具有统计学意义统计学意义是判断是判断生物学意义生物学意义的必要条件之一；的必要条件之一；判断生物学意义时要：（判断生物学意义时要：（1 1）纵向比较：剂量）纵向比较：剂量- -反应关系；反应关系；（2 2）横向比较：其它相关参数是否改变；）横向比较：其它相关参数是否改变；（3 3）与历史对照比较）与历史对照比较毒理学意义需要专家评价统计学意义和生物学意义的相关p131表6-

17、6九、优良实验室规范Good Laboratory Practice-GLP GLP专指毒理学安全性评价实验室的管理，是实验室质控要求，保证数据科学性、准确性、公正性。 要求：1 1）组织体制及责任体制明确化；组织体制及责任体制明确化；2 2）试验、操作规程的标准化；）试验、操作规程的标准化；3 3）按照）按照计划、操作规程实施试验；计划、操作规程实施试验；4 4）保存标本、记录；）保存标本、记录；5 5）积极地保证可信性。）积极地保证可信性。GLP基本精神是全面质量管理化学品安全性评价遵循GLP原则是国家法规要求的GLP认证单位三、动物实验的职业道德一般原则 人道主义的管理和处理 使痛觉和不

18、适感减到最小 避免不必要的使用动物3R 原则 replacement替代：用无知觉材料的科学方法替代有知觉脊椎动物的方法 reduction减少：保证数据信息前提下，尽量减少动物使用数量 refinement优化：必须使用动物时，减少非人道程序的影响 Lewise大鼠：近交系大鼠，白化，对诱发自身免疫心肌炎高度敏感，可诱发过敏性脑脊髓炎、过敏性关节炎和自身免疫复合物血管球性肾炎等立刻移植多种肿瘤，高脂肪食物容易引起肥胖症。 无特定病原体动物SPF：指体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物。来源于GF和GN，饲养于封闭的系统中。 SPF已成为国际上进行毒理学试验的标准实验动物。清洁动物CL：即最低限度无疾病动物，动物体内外不携带人畜共患疾病的病原体或动物传染病病原体。饲养于半屏蔽系统。（四）、个体选择性别：初次试验雌雄同用；存在差异分开统计；选敏感性别。年龄和体重：动物年龄依实验类型选择，取成年期数据。体重可作为判断年龄的指标。生理状态：