温石棉吸入毒理学研究报告

1、温石棉吸入毒理学研究报告 作者：-国际石棉协会（2003年 5月 ）       本研究项目由加拿大魁北克政府和魁北克蒙特利尔石棉学会提供赞助基金。联系人为 David Bernstein 博士，毒物学顾问,，40 chemin de la Petite-Boissière, 1208 日内瓦，瑞士。电子信箱：davidbitox.ch        动物对加拿大蛇纹石纤维各项吸入物的抵抗力 · David M. Bernstein · 毒理学顾问，日内瓦

2、，瑞士 · Rick Rogers · 罗杰成像公司，尼德姆，麻萨诸塞州,美国 · Paul Smith · 研究 & 咨询股份有限公司,Füllinsdorf,瑞士       纤维蛇纹石通常是与其他石棉材料中一同评价和分类的。然而，纤维蛇纹石是一种蛇纹石，与其他闪石相比，具有显著不同物理和化学性状（举例来说，青石棉，石棉状铁闪石，透闪石）。闪石是固态的杆状纤维，而纤维蛇纹石则是类似一条粗绳中的许多精细的纤维丝，并且容易展开。为了量化纤维蛇纹石从肺脏中被清除的机能和比率，一个

3、编号为QS等级为3-F的来自加拿大东部魁北克区的商业纤维蛇纹石试样被用作生物抵抗力分析，这个试样是长度最长的应用于纤维制品的商业等级。由于长的纤维已经被证明为最具有致病可能性，纤维蛇纹石试样被明确地选择为在暴露气溶胶中呈现含有长度超过 20 m 的 200个纤维每立方厘米。本文将阐述这次3个月 暴露后时期的研究 成果。这次研究设计包括：(1) 纤维清除率:(肺脏吸收) 在5天（6小时/天）吸入暴露后，1 天、2 天、7 天、14 天、1个月、 3个月和12个月(即将公布)的暴露后时期，各实验组的动物的肺脏经低温等离子体灰化，随后用传输电子共焦显微镜研究肺脏中含有的蛇纹石纤维数量和各种大小（长度

4、和直径）蛇纹石纤维在肺脏中的分布。(2)纤维分布:(共焦显微镜观察)：包含这个步骤是为了鉴定纤维在肺脏中的位置。经过 1天、2天、7天、14天、1个月、和3个月(即将公布)曝光后时期，使用公焦显微镜观察分析各实验组的动物的肺脏以确定其解剖学后果、倾向、以及纤维蛇纹石纤维残留沉积物在气管和软组织中的分布。据观察，纤维蛇纹石会被非常迅速的从肺脏中清除。长度超过20m的纤维的清除期为 T1/2=16天，很有可能是被溶化和崩解成为较短纤维。较短纤维的清除速度也很快，长度为5-20m的纤维的清除率 (T1/2=29.4 天)明显快于长度小于5m的纤维。长度小于5m的纤维的清除率为 (T1/2=107 天

5、)，属于清除不可溶解的有害粉尘的范畴。由于较长纤维的崩解会增加较短纤维的含量，因此不同速率的清除速度是可以理解的。较短纤维不会聚集成块，而是离散的细小纤维，通常在一端分叉。较短的游离纤维存在于肺泡内膜壁上，并且纤维或者其碎屑在肺泡的巨噬细胞里被发现。在淋巴组织中纤维也是类似，游离存在或者是在淋巴组织的巨噬细胞中。研究过程中没有发现蛇纹石纤维的存在会导致嗜中性介质的炎症反应。鉴于目前科学研究成果，本报告提供了崭新的确凿数据，明确揭示了纤维蛇纹石和闪石石棉之间的在流行病学方面的区别。        在流行病学和动物的毒物学研究中已经确认石

6、棉与某些疾病有关联。然而，在化学特性和矿物学特性上蛇纹石石棉与其他角闪石石棉差异明显，例如石棉状铁闪石，青石棉或透闪石。这造成部分研究员认为纤维蛇纹石不可能是有如同角闪石一般的特性并且可能可以被从肺脏中更快速地清除（Howard， 1984；Churg&DePaoli，1988； Mossman 及其研究同伴，1990；Morgan，1994；Churg，1994；McDonald，1997、1998；Rodelsperger 及其研究同伴，1999；McDonald及其研究同伴，1999）。为了调查肺脏的纤维蛇纹石清除机能和比率, 一项关于老鼠的吸入剂抵抗力研究采用了从加拿大魁北克的

7、东部镇区来的商业纤维蛇纹石的试样。 这项研究计划被设计为符合欧洲工会(EC)关于合成矿物纤维吸入剂生物抵抗力的暂定协议（Bernstein&Riego-Sintes，1999）。对于合成矿物纤维来说，对长度超过 20 µm 纤维丝的生物抵抗力与纤维治病可能性有关系（Bernstein 及其研究同伴，2001）。正如后文将描述的，在协议规范中，蛇纹石纤维的数量和大小的计量标准的严格程度超度矿业纤维。除此之外，纤维在肺脏里的分布也由显微镜检查确认。本文提供了经过暴露停止后90 天的现象结果。后继的论文将会提供在暴露停止后的 1 年呈现的进一步结果。  

8、0;     暴露和活体时期研究的执行地点是在瑞士 Füllinsdorf 研究与商议的股份有限公司。纤维计数和大小测量是在德国Neuss的 Gesellschaft für Schadstoffmessung und Auftragsanalytik(GSA)，的 RCC 的子契约之下执行。显微镜检查分析是在美国麻省尼德姆的罗杰成像公司。试验方法纤维蛇纹石试样的特征      蛇纹石纤维是单斜水晶体构造，并且有一个独特的卷曲构造，这种卷曲构造将在稍后描述。被用于这一项研究的纤维蛇纹石

9、在加拿大魁北克筛选规范 (QSS) 的分类编号是 QS 3-F 等级，并且这是在商业纤维等级中最长等级的纤维应用品.(Cossette&Delvaux,1979)       纤维蛇纹石的化学成分和构造与普通闪石显著不同，例如透闪石或者石棉状铁闪石等。 (Hodgson,1979)        表 1 概述了典型的蛇纹石和闪石石棉的化学成分。 纤维蛇纹石的化学成分是由含(Si2O5)n2n- 硅酸盐的硅层组成，在这个成分中每个四面体的三个 O 原子被相邻的四面体结构

10、以及一个成分为 Mg3O2(OH)4n2n+ 的非硅酸层一起分享。在纤维蛇纹石中规则（理想化）硅层各顶点的氧原子之间的距离 (0.305 nm) 要短于理想化含镁层中的 O-O 的距离 (0.342 nm)，这可以解释纤维层的卷缩，造成像地毯一样的卷曲形成空心的圆筒柱体（Skinner及其研究同伴，1988）。这个构造在图 1 中被举例说明（引用自 Skinner及其研究同伴，1988），并且图 2是纤维蛇纹石的传输电子显微像（Kiyohara，1991）。镁分子是在卷曲的外侧，从而暴露在周围的环境中。       于其相对

11、比，像是透闪石这类的闪石，基本的构造是I-beam键的形式，这种形式中角角连接的 (SiO4)4- 四面体之间的连接为双四面体链，链中夹着一个Ca2Mg5 层。与纤维蛇纹石相反，透闪石中镁原子被锁在 I-beam键的构造中。 这在图 3 中被举例说明。· 实验设计       这里显示的是在停止暴露后经过三个月的时期肺脏消化的测量结果，以及在停止暴露后的一个月的共焦显微镜检查结果。其后终止的部分是停止暴露后的十二个月的研究结果，将会在另一份公开文献中公布。表 1. 典型的化学成分 (百分比) 化合物 纤维

12、蛇纹石a 透闪石b 铁石棉c SIO2 40.6 55.10 49.7 AL2O3 0.7 1.14 0.4Fe2O32.30.320.03FeO1.32.0039.70MnO-0.100.22MgO39.825.656.44CaO0.611.451.04K2O0.20.290.63Na2O-0.140.09H2O+-3.521.83H2-0.160.09CO20.50.060.09燃烧损失14.0-总计10099.93100.26     &#

13、160;  a魁北克东部镇区的加拿大纤维蛇纹石的典型化学分析（LAB Chrysotile，Inc.， Quebec，Canada）。 Hodgson (1979， pp. 8081)。图 1. 示意图显示了纤蛇纹石的化学构造，镁分子的在卷曲的外侧。引自Skinner及其研究同伴 (1988)。       先前已经详细地阐述了活体实验设计和生物抵抗力分析( Bernstein 及其研究同伴，1994)，并且将在接下来的部分概述。计算的细节和测量大小步骤中将被反复论述，因为这些对于准确理解此次研究成果是非常必要的。动物暴露。

14、 实验组为 56个已经断奶的( 年龄大约为9 周)雄性Wistar幼鼠（特种无病原体）暴露在流动的纤维气溶胶中，气溶胶浓度为200个纤维L>20m/cm3，实验时间为 6小时/天，连续5天一个周期。这个浓度达到两倍于被 EC生物抵抗力协议规定，确认保证了充分的长纤维暴露。除此之外，一个对应的参照组暴露在条件相似过滤空气中。Wistar 鼠（HanBrl：WIST，SPF）的提供者为RCC 公司，生物技术和动物饲养分区， CH-4414 Füllinsdorf, 瑞士。        暴露系统。 在科学试验研究

15、之前准备样品纤维，用Cyloctec 样品碾磨机将其高速碾磨。样品先在耐磨表面的圆内壁上碾滚，然后通过微孔网筛。制作纤维气溶胶的系统被设计为不断发射纤维，而不中断、不碾磨、不污染纤维 ( Bernstein 及其研究同伴，1994)。动物被暴露在流动的仅口鼻部吸入气溶胶的暴露系统中。这一个系统起源于 Cannon及其研究同伴(1983)，并且不同于传统的暴露系统，传统系统中新鲜的纤维气溶胶的被分别地供应到每个动物而且呼出空气被迅速耗尽。图2. 纤维蛇纹石的传输电子显微照片，显示了其卷纸形的纤维（Kiyohara，1991）。图 3. 透闪石的化学构造示意图，显示出镁被锁定在l-beam键结构中

16、。改编授权者为威斯康辛州大学地质学和地球物理学系，晶体结构电影（/）。      清除纤维。在1天，2天，7天，2周，1个月，3个月和12个月（即将公布）的暴露后时期，各实验组的动物肺脏被低温浆化灰化处理，接下来藉着传输电子显微镜进行分析(在 GSA 法人组织)，研究肺脏内的总纤蛇纹石纤维数量和各规定尺寸纤蛇纹石纤维（长度和直径）在肺脏内的含量。这种肺脏处理步骤分析整个的肺脏，而没有可能区别纤维具体位于肺脏的什么位置。     纤维分布。这个步骤被用于区

17、别各种不同的肺脏区域里面纤维的分布。在1天，2天，7天，14天，1个月，和3个月（即将公布）的暴露后时期，各实验组的动物肺脏被共焦显微镜检查并且分析。蛇纹石纤维的位置分部在导气道，呼吸气道和软组织中被定量分析。肺脏消化吸收纤维/粒子的分析       在每个时间点，每组中七分之五的实验鼠的肺脏被融解，并且整个肺脏被准备用来分析。首先，有机组织被冰冻干燥脱水(Edwards EF4 Modulyo 冰冻干燥机)，并且干燥到恒重以确定干组织的重量。干燥的组织在一个 300 W 的在一个血浆系统 200(工艺血浆 GmbH) 多样的铅室血浆

18、单位中被分成血浆，时间大约为 16 小时。 在去除灰分的时候，来自每个肺脏的灰被秤重，而且用低强度超声波使其悬浮在 10 毫升甲醇液体中。 乳浊液然后被放入和燃烧器皿清洗的一个玻璃杯瓶之内转移，而且体积增加到 20 毫升。然后将一份等分试样用一个渡金聚碳酸酯滤片(0.2 m 的管孔大小) 过滤。       传输电子显微镜学的空气和肺脏试样的评价的计算规则。所有在 10,000 × 放大倍率下可见的所有纤维在考虑之列。在这一个放大倍率下被看到的所有物体都可以按一定精度限度测量其尺寸长度或直径。双变量的长度和直径被为每个物体分

19、别地记录测量值。纤维被定义为长宽尺寸比例至少是 3:1 的任何的物体。直径是由物体的最长宽度决定。所有的其他物体被认为是非纤维粒子。      为每个试样的计算停止规则依下列各项被定义：对于非纤维性粒子，当总计数达到 30个粒子被记录的时候，粒子的记录器被停止。 对于纤维，停止计数的条件是当记录达到 500个长度大于5m，直径小于3m的纤维 (通常被认为是WHO纤维，世界卫生组织，1985)，或者总计数为 1000个纤维和非纤维性粒子。如果在已经检查完成0,15 2的滤片表面时，仍然没有达到该计数，则将继续测量滤片其余的部分，直至计数达到500

20、个WHO纤维，或者测量的滤片表面的总面积达到 5 2，即使总计数不能达到 500个WHO纤维。短纤维(长度<5m) 的测量的停止的条件是当纤维计数达到 100 个短纤维。· 确证       纤维调查的分析步骤（肺脏消化和传输电子显微镜观察）被另一个独立的对照分析方法来确认，这个分析方法采用了共焦显微镜，共焦显微镜不会干扰测量试样（肺脏的一个立方体在三维中被分析），也不会在纤维分布或纤维计数方面产生偏差。纤维和肺脏组织的共焦成像       用共焦显微镜检查分

21、析的动物肺脏是固定在Karnovski固定剂中，由30cm水推动微小灌注从而浸入固定剂中。 随后结扎导气管，将膨胀的肺脏储存在相同的固定剂中。在固定之后，尖端的叶片被切分为五块 (10 mm2 × 5 mm厚)， 裂口平行于片皮蒂，用分级脱水到绝对干燥，再沾染 0.005% 的萤光黄，接下来嵌入带刺塑料中供显微镜分析（Rogers 及其研究同事，1999）。将含有植入的肺脏块的变硬的塑料块用来准备平坦表面。       共焦纤维量化分析。在每个时间点，用共焦显微镜检查随即选择的动物，共焦显微镜是 Sarastro2000(M

22、olecular Dynamics, Inc.) 激光扫描显微镜，集成了25 mW 的氢离子激光和一个直立的显微镜 (Optiphot-2; Nikon, Inc., or Zeiss Axiophot)，靠反映光源成像修正。这些共焦显微镜是利用双通道反射成像和荧光成像方式来记录图像数据。Sarastro 2000 CLSMs的视角台设定为：激发 488nm(黄色萤光)，可穿透大于510 nm 长距过滤器，激光能量为 1215 mW ，30% 穿透率，光电倍增管电压设定在 500伏和 800伏之间。利用这种配置，标志了萤光的细胞成分和可反射/可折射的纤维 ( 和粒子) 同时地被成像。 每次 &

23、quot;照射" 可生产两个完美配套的数字图像数据。       在每种方式中，每个图象记录是二维的（x，y），512×512个象素的数组, 每个象素为从 0 到 254个灰阶的亮度单位值（255值表示亮度的饱和值）。视角的（x，y）切片，是分别独立的，按深度系列，在各种不同的位置被记录，在计算机控制之下用步进电机沿着 z轴调整成像高度。用专门的计算机软件分析和处理图像以及系列图像。       图像是经过 40× 的显微镜目镜记录的。象素在记录

24、中的单位是（分别是x，y和 z 维）0.13 m，0.13m，和 0.3m。       形态度量学方法。在三维微观成像方法中，试样检查和图像抽样的策略很大程度上是由准备发表的问题决定的。虽然可以理解传统的灰化/电子显微镜成像技术可以更有效的解决关于纤维在整个肺脏里的大小和分布的问题，但是利用共焦显微镜的系列视角成像技术可以更有效的回答关于在不同解剖组织里的纤维的数量（不是尺寸）的问题。在许多例证中，独立纤维的真实长度是由连续的切片堆的体积的记录获得的。这通常是在纤维剖面是有向的，并且两个自由端是存在的情况。· 软组织的取样

25、策略       由于软组织占肺脏的大约 90% 的体积，并且肺脏各个区域中软组织变化不大，因而可以勿庸置疑的随机选择任意的肺脏区域的视角，从中获得定量的数据。我们的步骤是将显微镜目镜在随机放置于在嵌入环氧基树脂的肺脏标本表面上方，收集一系列深度的图像数据，回到初始深度，沿x 正方向移动二倍的区域宽度，随后重复先前过程。每块肺脏（每个动物区域的总数为100块）的二十五个不同深度系就用这种方式获得。 ( 如果遇到了肺脏切片的边界，显微镜目镜将被沿着y正方向移动二倍的区域宽度，接下来的步骤将沿着 x 负方向继续进行)。在每个位置，如果在系

26、列深度的记录的体积内有气道的剖面，则这个区域的视角将被略过，进入下一个步骤，直到找到不包含气道的体积。每块体积的记录是二十五个视角的切片数据，沿z方向相隔距离为0.3m。因而，体积的真实大小在x，y，x三维方向上分别是 61.6m×61.6m×7.5m。 在软组织有超过75,000个显微像的数据记录以获得足够的数量信息。       每个体积中的纤维数量是由人工操作计数的，他能够在不同深度系列的图片中上下地移动，以寻找反射的或折射的粒子和纤维的特征点或者特征线。计算纤维数量的技术员并不知道图像数据是来自什么实验组，

27、也就是说，计算是在“单一无知”的情况下进行的。这些计数提供了立方毫米的数量级下在每单位体积的软组织中的纤维的数量。 知道了每个深度系列表现的体积和动物整个肺脏的软组织（包括气隙）的体积，作为定值，肺脏的软组织内纤维负载可以被计算出来。       每当检测到一个纤维, 其在解剖学上的出现位置也被记录下来。当检测到自由端的纤维的时候，记录纤维长度是使用三维的测量技术。纤维出现在软组织中的分类是：在气泡中，在气泡间的气管中，或者在呼吸细支气管中，在与组织的表面连接面上；在气管或者气泡中，但是不在被记录的体积与软组织中；以及整个或

28、者部分在气泡的巨噬细胞之内。出现在其他软组织位置中的纤维，例如间质组织或气管淋巴组织 (BALT)归类在“其他的”记录中。 这些计数可以用来估计不同范畴内纤维存在的情况。· 气管的取样策略      气道只占膨胀了的肺脏总体积的10%，而且是树状分布结构，较软组织结构稍粗糙一些。 因此，在肺脏试样上随意选择的视野的区域中包含任何的气道剖面的概率相对很低。与之相反，在肺脏试样表面随机选择线，以及每当遇到一个内轴是与试样表面法线几乎平行的气隙，记录其体积是有效率而且准确的，在气道墙壁中的组织层被勿庸置疑地辨别确认。表 2. 蛇纹石暴露气溶

29、胶中的纤维大小和分布暴露组浓度重量公析(mg/cm3)所测纤维数量纤维数量cm3WHO纤维/cm3WHO纤维的百分比长度20µm 的纤维/c3 长度20µm 的WHO纤维/c3 空气参照组 02 0.3 0 0 0 0  加拿大蛇纹石4.32 (0.36)2482 14805 1849 13  2001        每个动物取 4个试样，每份试样取十个深度

30、系列（量度与软组织深度系相同）的记录，而且一般来说这些堆块，每块含有的气隙剖面为 75m。气隙部分取了超过 30,000个显微像，并且定量为气隙范畴。      这些肺脏的气道的平均直径被估计为300m，并且正如先前提到的，气隙的体积占肺脏的 10% 体积。这些数字用来进一步估计一个等效圆柱体的长度以及它的圆壁面积，这个圆柱体用来估计肺脏内总的气道壁面积。       有了单位面积的气道壁上的纤维的数据，总的气道隔室的纤维负荷就可以估计出来。· 炎症细胞  

31、;     炎症细胞的识别是源自系列图像数据中形态上的识别。细胞的分子形态和肺脏间质组织的分子形态是靠荧光物质的着色来区别。单核细胞，例如肺脏的巨噬细胞，容易区别于呈多形核白细胞轮廓的嗜中性白血球。结果动物对吸入物的抵抗力       EC 吸入剂的动物抵抗力协议规定动物的暴露大气中应该至少有 100个长度超过20m的纤维/3。这项研究结果表明，在暴露大气中长度超过20m的纤维数量可以有意地增加到 200个长度超过20m的纤维/3，以便使肺脏的纤维清除率上的任何的潜在效应达到最大值。表

32、2显示了纤维蛇纹石暴露组的纤维数，浓度和纤维大小和普通大气参照组。 直径范围 (µm)长度范围 (µm)GMD (µm)（标准偏差） GML (µm) （标准偏差）平均直径 (µm) （标准偏差）平均长度 (µm) （标准偏差）长度权重的 arthm直径 (µm)长度权重的几何直径(µm)方向系数0.05-0.131.5-1.30.082.290.092.50.070.0740.80.02-10.5-1100.122.420.143.320.160.1236.1    

33、60;  如图 4 所示，大气暴露中所有较长的纤维（L>20m）的直径都少于1m，甚至更少（99.6% 少于 0.8m）从而可以呼吸。图5显示了停止暴露1天以后肺脏内发现的纤维的长度和直径分布的双变量图。 在每个时间点发现的肺脏内的纤维的平均浓度和纤维的大小的数据在表 3 中被呈现。       图6和图7显示了使用扫描电子显微镜（SEM）拍摄的最初的试样块和气溶胶试的显微镜照片。这里使用SEM 是为了要提供纤维大小分布的视觉概观。正如先前提到的，使用传输电子显微镜 (TEM)来实际测量纤维的大小。 · 清除

34、纤维       如图8所示，肺脏内沉积的长度超过20m的纤维在肺脏里快速地 “消失”，长度超过20m的纤维的清除率半衰期为16天。清除率的半衰期（表4）是由EC 吸入剂生物抵抗力协议规定的（Bernstein&Riego-Sintes,1999）步骤确定的。数据按双指数拟合为清除率曲线，采用了非线性衰退技术(StatSoft，Inc，2003)。图 4. 暴露空气中的蛇纹石WHO纤维的长度和直径双变数柱状图。停止暴露1天后肺脏中的蛇纹石纤维 WHO纤维的长度直径双变数柱状图 图 5. 停止暴露1天后肺脏内发现的蛇纹石WHO纤

35、维的长度和直径双变数柱状图 在暴露30天以后，从消化整个肺脏的样品中，通过显微镜在滤片上检测到1.9个纤维。正如表3中显示，这符合先前的推断，即30天后每个肺脏中整个肺脏含有20,000个长度 L>20m。 类似的不可溶解的石棉状铁闪石纤维暴露之后30天以后，每个肺脏将会有大约是 1,000,000个L>20m的纤维残余（ Hesterberg 及其同事的外推法，1998）。       如表 5 所示，长度在5到20m之间的纤维能从肺脏中快速的清除，不过清除速率远远慢于长度L>20m 的纤维。520m 纤维和<

36、;5m的物体的清除率曲线的最佳拟合单指数拟合，也适合于使用非线性退化技术的数据（StatSoft，Inc.，2003）。虽然长度<5m 的物体的清除率半衰期最慢，这很有可能是由于较长的纤维被崩解造成的影响，这是补充较短纤维源。然而，长度<5mm的清除率半衰期是属于不能溶解的有害颗粒的清楚率半衰期范围 (Muhle 及其研究同事，1987；Stoeber及其研究同事，1970).表3. 由传输电子显微镜确认的肺脏平均负荷结果的数据摘要（纤维浓度：平均±标准偏差) 牺牲时间点（自停止暴露后的时间)参数1天2天7天2天1天3 天12天评估的纤维数量328.7±320.

37、9± 319.6± 314.0± 308.3± 226.1± -2.82.621.3-每片肺叶所含的总纤维数量（百万)95.68± 92.72± 93.94 ± 71.38± 56.76± 41.20± -13.6 21.2 19.6 3.7 5.4 2.9 -每片肺叶所含的WHO纤维数量（百万)11.0± 9.7 ± 12.1 ± 8.2 ± 5.6 ± 1.4± -3.3 4.2

38、0.2-WHO纤维占总纤维数量的百分比（%） 11.48 10.14 12.92 11.52 9.86 3.42-每片肺叶所含L > 20 µm 的纤维数量（百万)0.4 ± 0.3 ± 0.2 ± 0.1 ± 0.1 ± 0.02 ± -0.20.1 0.09 0.03 0.03 0.01-L > 20 µm纤维占总纤维数量的百分比（%） 0.36 0.28 0.24 0.18 0.14 0.06 -每片肺叶所含L 5-20µm的纤维数量（百万）10.7± 9.4 ± 1

39、1.9± 8.1 ± 5.6 ± 1.4± -3.24.1 2.51.1 1.30.2-L 5-20 µm纤维占总纤维数量的百分比（%） 11.12 9.88 12.68 11.329.76 3.36-每片肺叶所含L 5 µm的纤维数量（百万）84.7 ±83.0± 81.8 ± 63.1 ± 51.1 ± 39.8 ± -12 17.6 17.2 2.8 4.8 2.7-L 5 µm纤维占总纤维数量的百分比（%） 88.52 89.86 87.08 88.48 9

40、0.14 96.58-直径范围（µm） 0.02- 1.3 0.02- 1.10.03-10.03-0.09 0.03-0.09 0.02-0.8 -长度范围（µm） 0.07- 62 0.9-43 0.8- 46 0.8-42 0.8-40 0.7- 41 -平均直径（µm） 0.170.15 0.16 0.14 0.11 0.10-标准偏差 0.170.17 0.12 0.11 0.120.20-平均长度（µm） 2.932.70 3.11 2.87 2.732.33-标准偏差 8.84 7.34 7.22 6.37 5.79 10.77-GMD（&

41、#181;m） 0.14 0.12 0.13 0.11 0.09 0.07-标准偏差 2.112.25 1.99 1.98 2.23 2.51-GML（µm）2.29 2.17 2.51 2.33 2.231.85-标准偏差 3.44 3.30 2.99 2.992.97 3.59-长度权重的 arthm 直径（µm） 0.21 0.19 0.18 0.16 0.140.11-长度权重的几何直径 （µm）0.17 0.15 0.15 0.13 0.11 0.09-直径众数（µm） 0.16 0.10 0.12 0.110.060.05-长度众数（

42、1;m） 1.62 1.46 2.44 1.90 1.861.84-直径中位数（µm）0.16 0.14 0.15 0.11 0.09 0.07-长度中位数（µm）2.14 1.94 2.40 2.16 2.161.82-方向系数平均值 22.15 25.0626.88 26.86 30.65 31.84-所测颗粒数 0.20 00 0 0.2-每片肺叶所含颗粒数平均值（百万）0.002 0 0 0 0 0.002-每片肺叶所含 1 µm 颗粒数（百万） 0 0 0 0 0 0.002-每片肺叶所含 >1 -3 µm颗粒数（百万） 000000-每

43、片肺叶所含 >3 µm颗粒数（百万） 0.00200000-        图 6. 使用扫描电子显微镜拍摄的最初的纤蛇纹石试样的显微照片(SEM)。这里使用SEM 是为了要提供纤维的视觉的概观。正如先前提到的，使用传输电子显微镜 (TEM) 定量化测量纤维大小。       图7. 使用扫描电子显微镜拍摄的气溶胶中的纤蛇纹石试样的显微照片(SEM)。这里使用SEM 是为了要提供纤维的视觉的概观。正如先前提到的，使用传输电子显微镜 (TEM) 定量化

44、测量纤维大小。      加拿大纤蛇纹石被从肺脏中清除的过程 纤维长度 > 20 µm停止暴露后的时间 (天)        需要注意的是，每个时间点有五个肺脏被分析；然而，在图中有一些点是在彼此重叠的)。 中被呈现。( 4 天的时间的肺脏内长度超过20m的加拿大纤蛇纹石纤维的清除率。小菱形表示的单个肺脏内纤维的剩余百分比。实线是使用非线性退化技术双指数拟合的数据的清除率曲线。（StatSoft，Inc.，2003）回归系数在表 5 曲线图表现了在停止暴露之后 8. 图

45、 · 共焦显微镜分析       按照 EC 协议所定义的生物抵抗力研究在每个时间点测定整个的鼠肺脏的消化的纤维数量和大小分布。对灰化了的试样进行 TEM 分析只提供的纤维的总数和大小数据。它不能够测定纤维在肺脏里面的位置分布。表 4. 双指数拟合数据，纤维L > 20 µm，R = .80119，方差近似 64.190%    a1 A2 T1 T2 WT1/2 估值 65.9630.38 6.16 38.04 16.22 标准误差 19.78 19.04 3.2115.56 2.67 t(26)

46、 3.334161.59552 1.918053 2.44419 6.06857 p 水平0.00258 0.12268 0.066150 0.02161 0.00000 WT1/2： 带权重的清除半衰期（Bernstein & Riego-Sintes. 1999）。表 5. 各种长度纤蛇纹石纤维的清除半衰期 纤维长度清除半衰期 T1/2 > 20 µm WT1/2 = 16 天5-20 µm T1/2 = 29.4 天 < 5 µm T1/2 = 107 天 WT1/2: 有益清除的半衰期    &#

47、160;  为了测定在肺脏中剩余的纤维的位置分布，使用共焦显微镜分析了埋入在塑料中的肺脏的叶片。显微镜的离被测试样最近的一个透镜（目镜透镜），将光线聚焦到一个特定的距离。如果透镜设计和加工的很好，将会有一个平面使观测物体处于焦点中。为了有效地使用一个传统的显微镜，为了避免焦点平面上面和下面的组织破坏最终的成像质量，将材料切成非常薄的薄片是必需的。共焦显微镜在这方面超越了传统显微镜，因为它通过光线微孔产生非焦点光线，可以产生高质量的清晰图像，即使有物质不在焦点平面上。这意味着在检测之前不需要将标本切成薄片。相反地，这将有可能获得在焦点平面的图像，即便焦点平面深入到标本里面数十微米。肺脏

48、所含纤蛇纹石纤维在显微镜下的外观        用于测量肺脏内的纤蛇纹石纤维的分布的共焦方法的局限是150nm 点分辨率。因为大多数的纤维呈现纵轴的取向是各种不同的剖面，因此直径大于 150nm 的多数的纤维可以被检测。这提供了如图 9 所示的在1天后肺脏中长度超过 20m 所有纤维的正确计数，而所有这些 TEM 观察的纤维厚度超过 0.15m。直径大于0.15m的短纤维的数量比较小的纤维 (直径 <0.15m) 的数量多得多，因而也提供了这些长度得纤维位置分布精确数据。在图 10 中也是相似的结果，显示了使用TEM 研究 3个

49、月获得的结果。 值得注意的是直径 >0.15 m 的较短纤维 (尤其在长度小于 5m) 的数量正在减退，表明剩余的纤蛇纹石会持续地被肺脏的巨噬细胞清除或者溶解清除。停止暴露后1天后的肺脏内纤维长度 长  度 µm    *用传输电子显微镜观察确认肺脏的消化吸收过程        图9. 在停止暴露之后的 1 天，肺脏内恢复的纤维的长度直方图 (TEM)，这些纤维是直径 <0.15m 并且直径 >0.15m。 共焦显微镜检查测量具有 150nm 的精度限制，从而提供了肺

50、脏内长度超过 20m的所有纤维的精确计数，而所有这些 TEM 观察的纤维厚度超过 0.15m。直径大于0.15m的短纤维的数量比较小的纤维 (直径 <0.15m) 的数量多得多，因而也提供了这些长度得纤维位置分布精确数据。软组织的纤维负荷在所有暴露试验组中软组织承担了99的纤维载荷。       在停止暴露后的1天，百分之六十八的纤维和粒子在肺泡的巨噬细胞里面被发现，以及肺泡上皮组织、肺泡管和细支气管末端出现的废弃物，的 epithelia 上发生。这表明了在这个时间点，纤维在呼吸区域内重要的清除率。相似的现象出现在 暴露后2 天，7 天

51、，以及 14 天 时间点。         在停止暴露后的1个月，在肺泡的巨噬细胞内发现的纤维数减少到小于一半 (42%)，小于停止暴露后早期的时间点数据（68%，60%，69%，和 64% 分别在 1，2，7，和 14 天）。在暴露后1个月的时间点，观察到的纤维的平衡点位于气道上皮组织表面。注意这一点很重要，暴露后1个月的数据组相比于暴露后1天的数据组，所有纤维的92% 已经从肺脏里被清除了。      气管的纤维负荷. 如果将暴露后1天的气管的纤维负载计做 10

52、0%，则暴露后2天，7天，14天，和1个月的纤维负载分别是 69%,45%,54%, 和 29% 。        区分气管隔间里的纤维负荷. 在暴露后的1天，动物的气道中，31% 的粒子在气道巨噬细胞中被发现，与之对比，在暴露后的14天，58% 的粒子在动物的气道巨噬细胞中被发现。暴露后14天的一个例外是，在气道上皮细胞表面上检测到的纤维的数量较高。在气道上皮组织面上的纤维和游离在气道内腔中的纤维占 62% 的纤维负载，大约是两倍于气道巨噬细胞携带的纤维负载。这揭示了一个在气道里面持久稳定的有纤毛的上皮组织清除路径，于气道巨噬细胞清

53、除率相辅相成。肺脏软组织和气道中的纤维长度       各时间点的软组织内的纤维长度。纤维的平均长度是在 5.5 和 7.4m 之间。长度超过 20m 的纤维数字以5的倍数从暴露后1天的数据急剧减少到暴露后2天的数据。没有长度超过20m的纤维在暴露后1个月在软组织中被检测到。这些数据强烈证实，纤维在肺脏内表面和细胞接触时，被快速分解为较短纤维。        各时间点的气道内纤维长度。一般说来，气道内的纤维长度超过在软组织区域中的那些纤维的长度。大体上，平均纤维长度是在7到9

54、m的范围中。很少有长度超过20m的纤维能在任何的动物中被检测到，并且在停止暴露的1个月后，没有长度超过20m的纤维在随机收集成的图象数据中被观察到。 停止暴露三个月后肺脏内纤维的长度纤维直径 < 0,15µm并且 0,15µm * 长度 µm       *用变速电子显微镜观察确认肺脏的消化吸收过程        图 10. 在停止暴露之后的 3 个月，肺脏内恢复的纤维的长度直方图 (TEM)，这些纤维是直径 <0.15m 并且直径

55、>0.15m。 共焦显微镜检查测量具有 150nm 的精度限制，从而提供了肺脏内长度超过 20m的所有纤维的精确计数，而所有这些 TEM 观察的纤维厚度超过 0.15m。直径大于0.15m的短纤维的数量比较小的纤维 (直径 <0.15m) 的数量多得多，因而也提供了这些长度得纤维位置分布精确数据。炎症细胞。        在任何收集的数据体积的肺泡腔隙中没有检测到游离的嗜中性白血球。在检查的时间点，没有发现纤蛇纹石纤维激发嗜中性白血球斡旋的响应。日程安排共焦成像。     

56、  在停止暴露后的1天到30天的时间里，纤蛇纹石纤维在肺脏中的位置分布由共焦显微像显示，是通过识别着色处理的加拿大纤蛇纹石纤维和肺脏组织的剖面产生的图象数据。       在停止暴露后 1 天，纤蛇纹石纤维显示为已经在肺脏各处的气道和软组织中很好地分布扩散。如图 11 所示，纤维游离出现，很精细，有时候在一端开叉，并且没有发现簇成团状。在有绒毛的气道 (图 11 a) 的表面上可以发现纤维，在肺泡中(图 11 b)，肺泡的巨噬细胞中(图 11 c)，以及发现一些较短纤维被传送到肺脏远侧端的淋巴腺(图 11 d)中。 

57、0;      在停止暴露的1个月，图12显示了于停止暴露1天相同的四个区域(图 11)，这些是气道膜壁 (图12a) ，肺泡(图 12 b)，肺泡的巨噬细胞 (图 12 c) 中的纤维，以及肺脏远侧端的淋巴腺(图12d)。虽然仍有一些纤维在每个这些区域中被发现，但是值得注意的是观测到纤维的数量和长度非常明显地减少了。        在肺脏的软组织 (图 13) 和气道区域(图14) 使用共焦测试获得的纤维数据是显示为时间的一个函数。软组织和气道均被细分成四个隔室，下文将给出隔室的定义

58、。除此之外，存在的炎症细胞也被给出定义。 定义:      软组织       1. 接触肺泡，导管上皮组织：在系列切片中观察到的那些至少有一端或部分连接于肺泡以及肺泡导管的上皮组织的纤维。       2. 肺泡巨噬细胞：在系列切片中观察到的，已经完全被食菌细胞卷入或者部分与巨噬细胞在直接相连的纤维。这也包括有至少一端与肺泡的巨噬细胞连接的纤维。       3. 肺泡内观察导管气隙：在系列切片中观察到的

59、那些与肺泡以及肺泡导管上皮组织没有任何连接的纤维。       4. 软组织内的其他位置：在系列切片中观察到的那些至少有一端或者一部分与其他软组织连接的纤维，这些软组织包括亚上皮细胞、空隙的腔隙、淋巴导管或不定型构造的肺泡区域。        对於实质和气隙区域 , 在暴露的停止之後从 1 天到 30 天都在所有的区划中被观察的纤维数字中是有记号的减少。依照已经提到，纤维的大多数在实质中被大部份那些发现在齿槽的巨细胞被发现。 (图 11) 为暴露后 1个月，不再纤维是在内隙观

60、察。纤维（所有长度）在气道中的分布 占肺脏内总纤维数的百分比 停止暴露后的时间 图 13. 曲线图表现了在停止暴露之后 5 天的时间的肺脏内长度超过20m的加拿大纤蛇纹石纤维的清除率。小菱形表示的单个肺脏内纤维的剩余百分比。实线是使用非线性退化技术双指数拟合的数据的清除 纤维（所有长度）在气道中的分布 占肺脏内总纤维数的百分比 停止暴露后的时间        图 14. 纤维的数字定量使用共焦考试是显示当做时间的一个功能作为肺的空中航线区域。 如本文所定义，空中航线进入接着的四个区划之内被细分:在表面之上的纤维或在引导空中航

61、线的有睫毛的上皮里面的在空中航线里面;在纤维的空中航线流明部分中使不看得见碰触薄的纱织品;和在空中航线中的另外一个位置。        虽然这些 共焦图像提供定量化蛇纹石纤维是在肺脏中哪里,他们不是很重要在斡旋肺脏的溶出度方面的周围肺脏表面活化剂。几乎所有被观察的纤维是在表面活化剂层里面因此更不迟疑服从对和纤维蛇纹石的解质溶出度身为依靠扩散.(Atkinson,1973) 在加成， Etherington 及其研究同仁中。(1981) 已经显示巨噬细胞能在巨噬细胞膜的表面产生非常低的酸碱值和, 特别地，在包围粒子的巨噬细胞吞噬溶 体里

62、面，酸碱值评价同样地低的当做 3.5 被遇到。 纤维蛇纹石是最溶解的在如此酸的酸碱值。 当在酸碱值 <10 的与稀酸或平坦的水血管中膜连络中，镁已经被显示到从纤维的表面 (Hargreaves&泰勒,1946;Atkinson,1973;Nagy&柔皮剂,1952) 来的不迟疑地分离造成一个沥滤了的纤维时候.(Atkinson,1973)我们的研究结果对比较长的蛇纹石纤维的停止这些被计画的机理领先感到一致进入比较短之内块。讨论纤维的化学结构和快速清除        在纤维蛇纹石中，每个层的氢氧化镁部分是最靠近纤维

63、质表面和矽酸有四面的是在结构里面.(见图 1) 在水中，纤维蛇纹石的溶解有被显示被沥滤器溶液的缓冲能力影响, 由于可摘录的毫克和 SiO2 作用 逐渐增加的缓冲液强度增加的数量.(铁工,1973) 这个反力有决定是经过靠近矿物的表面水一个层被控制的扩散。      在肺脏中，在维氏溶解技巧中使用的雕塑上的广泛工户综合性的矿物纤维质 (SMF) 的溶解和吸入抵抗力 有显示肺脏有一个非常大的缓冲能力。 (Matson,1994) 这些研究有显示一个等效在维氏流量率中达到 1 毫升/ 最小要提供 SMF 的相同溶解率当做那在肺脏中发生。 除此之外，纤

64、蛇纹石是更溶解的在酸酸碱值而且如此可能被影响被完全或甚至巨噬细胞的纤维质的一部分的吞噬作用。        纤维蛇纹石被测试时，它出现如镁溶解，纤维质进入比较小的块之内分别地破断之。 因此，而隆块暴露於中一个非常大量的长纤维质 (200 纤维质 L>20 m/cm3,GMD=0.12 m), 一般观察被研究 (1个天在露光的停止之後) 的日子 6 已经很多的纤维质已经溶解/分解。 纤维剂量的传递和对比清除       估定多少被存放的剂量已经从分析 ( 日子 1 在暴露

65、的停止之後) 的第一个时间测点的肺脏被清除的而且什么比较的肺脏负荷在比较的纤维蛇纹石 一个闪石和一高度地溶解的纤维质, 我们从铁闪石石棉的一项吸入生物抵抗力 研究和溶解的石质纤维质 MMVF 34 比较来自这项研究的数据和那.( Kamstrup 及其研究同仁.,1998) 在 Hesterberg 及其研究同仁中。 (1998)研究,气溶胶露光浓度是 150 纤维质 L>20 m/cm3 。 GMD 那纤维质为 石棉状铁闪石和 MMVF 34 被写报告如 0.48m 和 0.73m 谁, 分别地.(长的纤维质的 GMD 不被写报告)当做比较早地描述，纤维蛇纹石露光浓度是有 0.12 m 的这些纤维质的 GMD 的 200 纤维质 L>20m/cm3 并且如此也是隆块。