血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳ppt课件

1、血清蛋白质聚丙血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘烯酰胺凝胶圆盘电泳电泳第六组 蛋白质的分别v蛋白质是生物大分子化合物，具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点蛋白质分别纯化的方法主要有：盐析、透析、超离心、电泳、离子交换层析、分子筛层析等方法。透析透析超速离心超速离心凝胶过滤层析凝胶过滤层析离子交换层析离子交换层析电泳技术的原理电泳技术的原理v电泳蛋白质在一定的pH溶液中可带有电荷，成为带电颗粒，在电场中向相反的电极方向泳动。由于蛋白质的分子量和电荷量不同，其在电场中的泳动速率也不同，从而将蛋白质分别成泳动速率快慢不等的条带。v电荷的来源v 蛋白质带有可解离的氨基-NH2和羧基(-COOH),是典型的两

2、性电解质，在一定PH条件下会解离带上电荷COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+PHPI PH=PI PH蛋白质阴离子蛋白质阴离子甘氨酸阴离子甘氨酸阴离子垂直板电泳的优点：垂直板电泳的优点：v外表积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更明晰。v可多个样品的电泳v胶板制造方便，易剥离，样品用量少，分辨率高。v胶版薄而透明，可制成干板，便于长期保管与扫描。v可进展双向电泳。血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只可以分别出56条区带，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分别出数十条区带。v实验器材与试剂v器材v圆盘电泳槽、电泳仪、脱色

3、摇床、染缸、微量加样器、注射器、小烧杯v试剂缓冲液PH值准确配置后用PH计调试试剂编号试剂名称配置14*分离胶缓冲液1mol/L盐酸24.0mL/100mL, Tris 18.2g/100mL (pH 8.9)230%单体交联剂丙烯酰胺30.0g与甲叉双丙烯酰胺0.8g 100mL3催化剂10%过硫酸铵 （临用前配置）4加速剂TEMED 1mL加蒸馏水到10mL54*浓缩胶缓冲剂mol/L 盐酸48mL/100mL, Tris 5.98g/100mL (pH6.7)610*电极缓冲剂甘氨酸28.8g与Tris 6.0g 加蒸馏水至100mL 稀释(pH 8.3)临用前十倍稀释72*上样缓冲剂溴

4、酚蓝0.05g 20mL甘油，加5号试剂25mL，定溶至100mL8固定液三氯乙酸12.50g 加蒸馏水至100mL9考马斯亮蓝R250染色液1.25g考马斯亮蓝R250,溶于227mL甲醇中加蒸馏水227mL冰醋酸46mL10脱色液甲醇:冰醋酸:水按3:1:6比例配合v实验操作v凝胶柱的预备凝胶溶液配制表见教材表4-4取 玻 璃 管 ，一 段 封 口参与分别胶溶液(7cm)参与蒸馏水制备分别胶应迅速为了使外表平整，与空气隔绝静 置 待 凝 胶聚合浓缩胶制备(1cm)汲取上外表蒸馏水待凝胶与水面的界面重新可辨切勿触动胶面参见分别胶参与分别胶溶液(7cm)制备分别胶应迅速参与分别胶溶液(7cm)

5、制备分别胶应迅速参与分别胶溶液(7cm)制备分别胶应迅速参与分别胶溶液(7cm)制备分别胶应迅速参与蒸馏水为了使外表平整，与空气隔绝取 玻 璃 管 ，一 段 封 口参与分别胶溶液(7cm)制备分别胶应迅速取 玻 璃 管 ，一 段 封 口参与分别胶溶液(7cm)制备分别胶应迅速取 玻 璃 管 ，一 段 封 口参与蒸馏水为了使外表平整，与空气隔绝参与分别胶溶液(7cm)制备分别胶应迅速取 玻 璃 管 ，一 段 封 口v装柱v 将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，参与电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡(上电极槽以电极和凝胶管完全浸入为宜，下电极槽以凝胶管浸入3/5为宜)v加样v 取血清

6、12L ，7号试剂12L混匀，品均参与4管，每管6L.加样枪不可插入过深，以免刺破凝胶，同时要缓慢、均匀，以免搅动缓冲液引起样品分散。v电泳v 接通电源，上负下正，先调理电流1mA/管，待示踪染料进入分别胶后调理为23 mA/管，待示踪染料离管下口0.5cm时切断电源。v剥胶v 注入蒸馏水做光滑剂，针头螺旋式前进，渐渐剥离。v固定、染色及漂洗v 将凝胶柱浸入8号剂中泡10min，进展固定，用9号剂染色10min，用清水冲洗，放入10号剂中漂洗脱色。v结果表示图 2 1本卷须知：v丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，留意防止直接接触留意防止直接接触v丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，用前检测丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，用前检测pH值值能否失效。失效液不能聚合。能否失效。失效液不能聚合。v加速剂加速剂TEMED要密封保管，过硫酸溶液现配现用，防止氧化要密封保管，过硫酸溶液现配现用，防止氧化失效。失效。v配好胶后应尽快灌胶不要构成气泡配好胶后应尽快灌胶不要构成气泡v切记装柱后运用蒸馏水密封切记装柱后运用蒸馏水密封v灌胶和电泳时要留意排