第七章植物基因工程1-4

1、第八章 植物基因工程基因工程：在基因的水平上改造生物的技术体系，是指在体外对生物DNA进行剪切、加工，把不同亲本的DNA分子重新组合，并把它引入细胞中表达出具有新的遗传特性的生物这一过程。植物基因工程：又称植物遗传转化/转基因，是将外源基因转移到植物细胞内，并稳定地整合、表达与遗传的技术。目的是改变植物性状，培育高产、优质high yield、抗逆新品种/系；或者利用转基因植物/细胞来生产外源基因的表达产物。植物转基因研究的用途：1）理论研究：如基因功能分析；2）实践应用：如作物遗传改良。基因工程的基本内容 1）目的基因的分离；2）目的基因与载体连接；3）重组分子转入寄主细胞并繁殖；4）阳性克

2、隆的筛选；5）从阳性克隆中提取已扩增的目的基因；6）目的基因克隆到表达载体，导入寄主细胞并表达。植物基因工程的一般流程目的基因的分离表达载体的构建植物遗传转化转化体的筛选、鉴定与植株再生转基因植物的分子检测 转基因植物的表型鉴定 转基因植物的遗传分析、田间试验经遗传改良的生物, 统称：genetically modified organism (GMO)；Genetically engineered organism (GEO)。转基因植物 (transgenic plants), 又称：genetically modified plant (GMP)； genetically modifie

3、d crop (GMC)。第一节 目的基因的分离目的基因：已经或准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或 DNA 片段，称为。可能是:1）全长基因：外显子+内含子+转录启动区+终止区；2）全长cDNA：UTR区+编码区（ORF）；3）开放读框/编码区（ORF，CDS）；信使核糖核酸(mRNA)分子中能翻译成多肽的那部分序列。来自DNA分子中的外显子。 4）一个完整的操纵子或基因簇；5）只含启动子或终止子等元件的 DNA 片段。1. 分离目的基因的策略/方法：1) 基于已知/同源序列分子杂交/筛库与PCR；cDNA文库和基因组文库（1）构建基因组文库或cDNA文库；基因组文库：将生物基因组DNA

4、切割成一定大小的片段，与合适的载体连接并导入宿主细胞，进行扩增。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，包含该生物所有的基因。 cDNA文库 (cDNA library)：以某一组织、器官或处理材料中的mRNA为模板，逆转录成双链cDNA 分子，插入载体形成重组分子，再导入宿主细胞进行扩增。这些在重组体内的cDNA的集合，即为cDNA文库，包含正在表达的基因。 （2）用已知或同源序列标记探针、筛库。经典、较常用。筛库菌落原位杂交 如果所要获得的基因在其它植物上已经分离 ,序列已知 ,则可以采取以下两种方法分离研究植物上的相关基因:一是基因序列同源克隆法。根据发表的序列设计

5、引物 ,以基因组 DNA 或 mRNA 反转录的cDNA 为模板进行 PCR 扩增。如果得到的只是基因部分序列 ,可以将其克隆至载体 ,作为探针筛选cDNA文库和基因组(gDNA)文库获得全长基因或用 RACE得到全长基因。二是用作探针直接筛库。若能得到其它植物已分离的相关基因 ,则可以直接用作探针筛选 cDNA 文库和基因组(gDNA)文库 ,获得研究植物里的基因.（3）用PCR技术扩增目的基因gDNA-PCR;RT-PCRRACE-PCR；简捷、常用2) 基于转录本表达差异DDRT-PCR：mRNA差异显示技术，DDRT-PCR: 根据真核生物3 端poly(A)尾的特点设计锚定引物, 这

6、些引物组合扩增后约能得到大致包括某一发育阶段的全部基因 ,扩增后利用测序胶分离 ,放射自显影或银染获得结果 ,并对差异片段回收、 克隆、 测序以确定其是否为目的基因。SSH：抑制性差减杂交，此技术是以抑制 PCR和杂交二级动力学为基础的DNA扣除杂交方法。含有目的基因的样品称为检测方,不含有目的基因的样品称为驱动方。3) 基于人工突变体T-DNA标签法与 转座子标签法 ；适用于模式植物T-DNA: 根癌农杆菌Ti质粒中一段可转移DNA，插入基因引起突变。机制：T-DNA 或转座子随机插入到基因组的某一位点 ,引起该位点基因功能改变 ,这个位点就被标记 ,再利用 T-DNA 或转座子序列探针对突

7、变基因组文库进行筛选或设计引物扩增 ,就可以分离出标记位点的基因。4) 基于分子标记连锁图谱图位/定位克隆；要求精细物理图谱等图位克隆：从一种基因的染色体定位出发，逐步缩小范围，最后克隆该基因，又叫定位克隆。机制：根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座位 ,利用分子标记对目的基因进行精细定位 ,并用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选 DNA 文库 (包括 Y AC、 BAC、TAC、 PAC或 Cosmid库) ,从而构建目的基因区域的物理图谱 ,再利用此物理图谱通过染色体步查(chromos ome walking )逐步逼近目的基因或通过染色体着陆(chromos ome landing

8、)的方法最终找到含有目的基因的克隆 ,再经过遗传转化证实目的基因的功能.图位克隆的技术环节（1）构建遗传作图群体用于作图群体的类型可有多种。（2）筛选与目标基因连锁的分子标记。（3）局部区域的精细定位、作图（4）构建高质量的基因组文库（5）染色体步行、登陆。（6） 鉴定目标基因 图位克隆的基本流程：（1）构建遗传图谱：目的基因初步定位分子标记；（2）构建物理图谱：局部区域的精细作图，目的基因精细定位 (kb/cM)；（3）构建基因组文库：BAC、YAC、Cosmid等；（4）染色体步行或登陆：获得候选克隆 探针；（5）筛选基因文库：获得目的克隆；（6）鉴定目的基因。5) 其他方法人工合成，适用

9、于小基因、突变或修饰；基因表达谱(Macroarray/Microarray)分析:基因芯片/微矩阵第二节 基因克隆的主要工具酶1. 限制性核酸内切酶限制作用:指宿主细胞利用限制酶降解外源DNA，保护其遗传稳定的现象。修饰作用: 指宿主细胞通过甲基化酶使自身DNA进行甲基化修饰, 达到识别自身和外来DNA 、使自身DNA免遭限制酶降解的现象两种末端粘性末端：酶切位点在两条DNA单链上反向互补，产生的两个末端碱基互补配对，易连接。 平齐末端： 酶切位点在两条DNA单链上相同，形成平齐末端，较难连接。限制酶：一类能识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割双链DNA分子的核酸水解酶，水解

10、DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为P，3端为OH。 2. DNA连接酶DNA连接酶：催化双链DNA切口（nick, 而非裂口/缺口 gap) 处的5-P和3-OH生成磷酸二酯键，需能量。T4 DNA连接酶: 需ATP，制备容易，连接具有粘性末端或平末端的DNA分子，应用广泛。 3. DNA聚合酶1) E.coli DNApol I：制备探针、缺口填充等。2) Klenow片段(E.coli DNApol I 经蛋白酶处理, 获得N端三分之二的大肽段) : 补平粘端、DNA片段末端标记、cDNA第二链的合成等。 3) 逆转录酶：RNA依赖的DNA聚合酶，合成cDNA链。AMV和MLV

11、。4) 耐热 DNA 聚合酶：Taq DNA 酶、 Pfu DNA 聚合酶等。第三节 受体细胞/系统定义：外源DNA导入、扩增、表达的细胞。对受体菌的要求: ）易于转化或转导：感受态；）限制-修饰系统缺陷型；）重组系统缺陷型：recA、 recB等失活； ）有明显的选择性差异，便于重组子筛选；）载体复制、扩增不受阻；）感染寄生缺陷型。常用Ecoli K12 派生株系。第四节 植物转化/表达载体1. 载体（vector）: 将外源 DNA 携带进入宿主细胞的工具，本质是DNA。载体的基本构件：1）自主复制元件，或能整合在宿主基因组进行复制；2）多克隆位点（MCS）: 插入外源DNA；3）选择标记

12、：如抗性基因，筛选重组子；4）基因表达元件：启动子、终止子。基因工程中所用的载体按功能分：1）克隆载体：外源基因的保持与扩增；2）表达载体：外源基因的表达（转录与翻译）。2. 植物转化载体的种类与特点2.1 植物病毒载体类型：单链RNA病毒、单链DNA病毒、双链DNA病毒。构建策略：通过置换或插入等方法，去除基因组中的致病基因或不重要区域，插入外源基因。由CaMV (花椰菜花叶病毒)、 TGMV(番茄金色花叶病毒）、BMV (雀麦花叶病毒）、CPMV(豇豆花叶病毒）构建的载体已得到转化植株或细胞。病毒载体的优点：1）能将外源基因直接导入完整植株，并系统地分布到整株，免去组培再生操作；2）不受单

13、、双子叶寄主的限制；3）外源基因随病毒基因组快速、大量复制，易得到基因表达产物；4）一般不整合到植物基因组，不影响植物基因表达。病毒载体的缺点：1）外源基因不能整合到植物基因组，瞬时表达，故不能稳定遗传；2）存在致病的可能性；3）由于病毒的高变异性，使外源基因exogenous易于丢失。 病毒载体的应用：1) 基因功能研究：主要领域，瞬时表达。病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silence，VIGS）技术：近几年发展，用携带目标基因的病毒载体侵染植物，诱导相关基因沉默，根据表型推断目标基因的功能。2) 生产疫苗等医用蛋白。2.2 农杆菌质粒载体农杆菌：土壤杆菌，G-，

14、主要侵染双子叶，致瘤。根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens )：诱发产生冠瘿瘤， 致瘤性来自Ti质粒。发根农杆菌 (A.rhizogenes): 诱发产生毛根症，病症来自Ri质粒经改造后的Ti 和 Ri质粒是植物转化的理想载体。2.2.1 根癌农杆菌Ti质粒Ti质粒：1974年分离, 160 - 240 kb, 大型环状双链DNA分子。其与植物DNA结合的部分（称为 TDNA） T-DNA： 1977年证明，是Ti质粒上一段可转移到植物细胞并整合在染色体上的DNA， 载有诱导冠瘿瘤的基因。Ti质粒的类型根据所合成的冠瘿碱种类，分4类：1）章鱼碱型(octopine

15、type)；2）胭脂碱型(nopaline type)；3）农杆碱型；4）农杆菌素碱型/琥珀碱型。冠瘿碱：氨基酸类似物，农杆菌的碳源和氮源。Ti 质粒的结构与功能Ti质粒的分区：1) T-DNA区T-DNA：转移到植物细胞并整合在植物核基因组的一段DNA，通常23kb (12 - 24 kb )，载有致瘤基因和冠瘿碱合成酶基因，以及左、右边界重复序列LB和RB。功能：转移到植物细胞，致瘤基因产物可使侵染部位产生冠瘿瘤。2) Vir 区Vir 区：毒性区，3540kb, 含7个基因/操纵子。功能：接受植物创伤信号分子，启动Vir基因表达，协同其他因子完成T-DNA解旋、单链切割、加工及转移等过程

16、，使农杆菌表现毒性。3) Ori区复制起始区，调控质粒自我复制。4) Con区接合转移编码区，编码与接合转移有关的基因（tra）。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移。5)冠瘿碱代谢区分解利用冠瘿碱作为自己的碳源和氮源。2.2.2 发根农杆菌Ri质粒Ri质粒：200800kb，与Ti质粒结构相似。根据冠瘿碱的种类, 可将Ri质粒分为三类 甘露碱型, 合成甘露碱、甘露碱酸、农杆碱酸和农杆碱素, 黄瓜碱型, 合成黄瓜碱 农杆碱型, 合成农杆碱、农杆碱酸、甘露碱、甘露碱酸和农杆碱素。 Ri质粒的优点：1）诱导的不定根可分化成完整再生植株，载体可不解除武装（onc+载体）；2）每条发状根是一个单细

17、胞克隆，可避免嵌合体；3）发状根适于离体培养，而且具有原植株的次生代谢物合成能力，可用于次生代谢物生产。3. 野生型Ti 质粒的转移与致瘤性 3.1 T-DNA 的结构与功能T-DNA ：含2类基因：1） 致瘤基因: tms和tmr，即生长素与细胞分裂素合成基因，可致瘤；2） 冠瘿碱合成酶基因: tmt，冠瘿碱是农杆菌生长的碳源和氮源。有2个保守序列：LB和RB：即左边界和右边界，25bp正向重复序列，缺失RB则不能转移。 章鱼碱型与胭脂碱型T-DNA 的差别胭脂碱型：T-DNA是连续的片段，编码13个基因；章鱼碱型：T-DNA由2个分离的片段组成，左区（TL-DNA）14kb, 有8个基因，

18、右区（TR-DNA）7kb, 有5个基因；LB右边约17bp处有一个24bp的超驱动序列OD ，促进T链形成，起转移增强子作用。 3.2 Vir区基因的结构与功能章鱼碱型：含有virA、virB、virC、virD、virE、virF、virG、virH等操纵子/基因；胭脂碱型：含有Tzs、virA、virB、virC、virD、virE、virG等操纵子/基因；除virF 外，其他vir 基因的突变均能消除或减弱农杆菌的致病性。3.3 T-DNA的转移与整合机理 3.3.1 T-DNA的转移植物创伤释放乙酰丁香酮农杆菌附着乙酰丁香酮与VirA结合并激活VirA 激活VirG诱导Vir基因表达

19、 VirD先后在同一条T-DNA单链的RB和LB特定位点切割、释放T-DNA单链/T链VirD2、VirE2等与T链形成复合物VirB形成跨膜通道 RB及VirD2、VirE2所含NLS(nulear localization signals)引导T链以类接合方式进入植物细胞。VirD区：有VirD14四个ORF。VirD1 编码DNA松弛酶；VirD2 有限性核酸内切酶活性（N端）以及NLS信号 nulear localization signals （2个），可在T-DNA的LB、RB序列进行特异性切割，并与释放的T-DNA单链5端结合、引导其向核转运；VirD3保守性很小，功能不清楚；V

20、irD4蛋白N端有信号肽，引导其到达内膜，其C端可能与周质腔中的因子结合。3.3.2 T-DNA的整合T链以非正常重组方式随机插入染色体某一位点，并在植物重组修复系统作用下形成双链，整合到基因组。整合不依赖序列相似性，但插入位点常有下列特征：1）优先插入到转录活跃的基因位点；2）T-DNA与植物DNA连接处富含A/T；3）插入位点与T-DNA边界序列有一定同源性；4）插入位点常有一些额外序列，称为填充DNA； 5）插入位点常有缺失、到位和重复。 一些植物蛋白参与整合，但机理不清楚。T-DNA整合的模型：Mayerhofer等。1）双链断裂修复模型Double-Stranded Breaking

21、 Repair (DSBR model): 植物靶DNA产生双链断裂，解旋的靶DNA与双链T-DNA退火；单链部分被降解去除；随后进行修复连接，并由此导致DNA 的整合和缺失；靶DNA和T-DNA缺失程度由二者互补顺序的位置所决定。2）单链缺口修复模型Single-stranded Gap Repair (SSGR model):在靶DNA上形成1个缺刻 部分解旋或外切酶消化形成缺口 T-链靠近缺口，末端经互补序列退火，形成异源双链 T-链的单链部分被降解去除 T-链末端与靶DNA连接 靶DNA的上链产生缺口 以T链为模板，合成第二条T-NDA链。3.3.3 T-DNA的致瘤机理 T-DNA整

22、合于植物染色体DNA后，其上的致瘤/激素基因表达，细胞不规则分裂形成肿瘤。离体培养下，T-DNA导入植物后抑制细胞分化和植株再生。小结：1）农杆菌被植物创伤信号分子吸引并附着于植物细胞；2） VirA受体与信号分子结合并被激活；3）其他Vir基因被诱导表达；4）T-链复合体的形成与导入；5）T-DNA整合；6）T-DNA上的致瘤基因表达，形成肿瘤。4. Ti质粒载体的构建4.1 构建策略除去T-DNA上的致瘤基因，使植株再生； 除去T-DNA上冠瘿碱合成基因，不消耗底物氨基酸，利于植物细胞生长；除去其它非必需序列，缩短载体长度；加入多克隆位点MCS，便于外源基因的克隆；加入E.coli ori

23、及选择标记，使在E.coli中复制，便于克隆操作；加入启动子与终止子, 使目的基因表达；加入植物选择标记，便于转化细胞的筛选。4.2 常用的Ti质粒载体系统4.2.1 共整合载体系统由卸甲载体与中间载体构建物而成的一元载体系统。卸甲载体（onc-）：去除致瘤基因，删除部位被质粒载体pBR322取代的Ti质粒载体被称为 ，可以转化植物。任何克隆在pBR322中的外源DNA片段，都可通过与卸甲载体中的pBR322质粒DNA进行同源重组而被整合到卸甲载体（受体）上。常用的卸甲载体：pGV3850、pGV2250、pTiB6S3-SE。共整合载体：当E.coli与农杆菌接合转移时，由中间载体和卸甲载体

24、经pBR322序列同源重组，在农杆菌中产生的一种大型的复合载体，称为。目的基因定位在Ti质粒的T-DNA边界序列之间，用该共整合载体转化植物，转化细胞可再生完整植株。4.2.2 双元载体系统 包含2个独立的质粒：1）穿梭质粒：能在E.coli 和 A.t.(农杆菌）中生存/穿梭，克隆载体，T-DNA区插入目的基因、MCS和植物选择标记基因。2）Ti 卸甲载体：含 vir基因和复制起始区ori A，缺失T-DNA，辅助质粒，促使T-DNA 转移。特点：Vir 基因与T-DNA分开存在于2种质粒，当E.coli 与 A.t.发生接合转移后，2种质粒可在A.t.细胞内独立共存；当A.t.感染植物时，Ti 卸甲载体产生的 Vir蛋白与穿梭质粒的RB互作，使带有目的基因的T-DNA转移到植物细胞。4.3 外源基因表达调控序列 外源基因：任何非受体细胞本身的基因，包括目的基因、选择标记基因和报告基因。常用表达调控序列 ：CaMV 3