分子试验室、细胞试验室常用配方

1、分子实验室、细胞实验室常用配 方作者:日期:一WB相关试剂及常用缓冲液RI P A ( 1 0 0mI )(最后要调 pH 为 7 .4)终浓度分子量称取T r i s-HCI (pH 7 .4)50mM1 2 1.1460 5. 7mgNaCI150mM5 8.4 487 6 . 6 m gTrit 0 nX-1 0 01%1mI脱氧胆酸钠1%1 gEDTA1 mM292.24 82 9 .224 8 mgSDS0. 1%0.1gP MSF (1 00 mM)使用时每1 ml加10 u l10%±硫酸钱溶液 AP 分装彳存于-20度AP粉末1gddH 2O 10m11 0 %SDS

2、1二烷基硫酸钠：SD S粉末1 0gddH0定容到100ml注意：用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡30 mL10g30 mL9 .3g0 . 0 6g定容至10 0 mL6X 蛋白质 sample buffer Tris-HCl 1 M,p H6. 8 S D S甘油DTT 1 5 4. 2 5 澳酚蓝 dd H2O10XPBS缓冲液的配制：NaCl80gKCl2gNa2HPO 414. 4g (十二水合 36g)KH PO0 2.4 g加800 mLddH2O根据开始的pH用N aOH或H CL调pH到7 .4,调好pH再定容到1升.配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度pbst (1X)

3、500mlPBS(1X)Tween 2 050 X Tris 乙酸TAE缓冲液配制Tris粉末冰醋酸Na 2EDTA- 2H2.1L溶液各成分的用量4 2g57. 1ml37 . 2 gddH20定容到封闭液脱脂奶粉5g叠氮钠0. 02g现配现用时可不加PBS定容至U 1 0 0mL染色液室温1 L500ml200ml100ml甲醇5 0 0mL25 010050乙酸10 0 mL502010R25 0考马斯亮蓝0.5g0.2 5 g0 .1 g0 . 05 gH204 0 0 mL20 08040脱色液:室温8.8Buffer:甲醇165mL乙酸5 0 m LH2 0785 mL调p H至8

4、. 8 , 4度保存1 0 0ml200 mlTris18. 17g3 6. 3 4g1 0 % SDS4mL8 mlddd 0定容至100mL200ml6. 8 Buf f e r:调 pH 至 6 .8, 4 度保存10 0ml200 mlTris6. 0 6g12. 1 2g10% SDS4mL8mlddH20定容至1 00mL20 0 ml转移缓冲液1 0 x tr a ns buf f e r :常温保存1L2 L酸1 4 4g288 gTr i s粉末30. 3 g60.6d dH20定容至1 L定容至2L使用时甲醇200m L转移缓冲液1 0 X 10 0 m Ld dH 207

5、00 mL电泳缓冲液1 0 x r un n ing b u ffe r :常温保存1 L2 L酸144g28 8 gTris粉末30.3g60.6SDS10g20 gddH0定容至1L定容至2L10XTBS:常温保存Na Cl80.0 gT r is粉末ddH2024 . 2g定容至1 LSt r ippi n g b uffer( 10% SDS 殍前基乙醇Tri s - H CI (pH6 . 8 ) 参加ddH 2 OT BS T( 1 X )T B S(1X)5 0 0mlTwee n 2 05 0 0 dl可反复利用)温老师组配方10 ml35 0 l6.2 5m 1 ( 6 .0

6、 6 加到 50mL水)至 5 0 mLSt r i p ping buffer (可反复利用)郭老师给配方甘氨酸15gS DS1 gTw een 201 mld d ddHO1L作这个buffer洗20min,然后用PBST洗3次,再重新封闭孵抗体.二细胞和细菌培养基、抗生素LB培养基 当天灭菌后放4度存放100 0 ml500ml3 0 0 m 12 5 0 ml200 ml氯化钠10g5 g3 g2. 5g2g蛋白月东10g5g3 g2 . 5g2g酵母提取物5g2.5g1.5 g1.25 g1gdd H20定容至1 000m l定容至500ml定容至3 0 0ml定容至2 50m l定

7、容至 200mlLB平板：当天灭菌后倒平板,放4度存放1000 m l50 0 ml3 0 0 ml250 ml2 00 ml氯化钠10g5g3g2 . 5g2g蛋白月东1 o g5 g3 g2.5gpg酵母提取物5g2. 5g1.5g1.25gi g琼脂1 5 g7. 5 g4.5g3. 725g3gddH 2.定容至1000m1定容至500ml定容至 300 m l定容至250ml定容至2 0 0 m lS O B培养基将以下组分溶解在0. 9L水中： 演白月东2 0g滞母提取物5g?g化钠0.5g1mol /L 氯化钾 2 . 5m l用水补足体积到1L.分成1 00ml的小份,高压灭菌

8、.培养基冷却到室温后,再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁1M I PTG 异丙基硫代-3-D-半乳糖甘分子量为2 38. 3溶液I P TG粉末2. 383gddH0定容到10ml用0. 22 dm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20 C.Amp + (50mg/ml)Amp舲末 ddH20 注意：分装保存于2 0度50 mg1ml,使用时按10 0 0:1的比例用Kana+ (5 0mg /ml)Kana + 粉末50mgddH2 01 ml注意：分装保存于-20度,使用时按1 000: 1的比例用胰酶：抽滤,长期保存可放负20度 粉末 0. 25gEDT A0

9、.02-0.03g1XPB S 100 ml高糖DM E M培养基: 抽滤保存在4度粉末全部碳酸氢钠3 .7gddH20定容到1L (用盐酸调 pH值到：7. 2-7 . 4)G418母液(1 00m g/ml )用0 .22 M滤菌,分装存于-20度粉末 1gPBS1 0mlzeocin母液(100mg /ml )用0 .22 M滤菌,分装存于-2 0度粉末1gd d H2 O 1 0mlBla s ticidi n ( 1 0 0 mg/ml)用 0.22 M滤菌,分装存于一2 0 度粉末 0 . 3gPBS1 0 ml(三)利用His-tag从细菌中纯化蛋白配方透析液配方终浓度母液浓度量

10、取体积T r i s- H C l(pH:8 . 0)2 0mM1 M20mlNaC l20mM4M5 mlMg Cl 22mM1 M2 m 1DTT1mM1 M1 m l甘油50%500 mlddHO472 ml超声裂解液(lysis buff e r) 2021年做蛋白纯化时用Na 3PO4(164)8.2 g ( 5 0m M)Na Cl (58.5 )1 7.55 g (30 0 mM)力口 8 0 0 mL ddH2O溶解,用2M NaOH或者2 M HCL调pH到8.0,再定容到1升.配 好后用高压蒸气灭菌后常温保存.洗涤液(w a sh buffer) 20 11年做蛋白纯化时用

11、NaPO8 . 2 g(5 0 mM)Na Cl1 7.55g(300mM)咪口坐0 . 6 8 1 g ( 1 0 mM)力口 80 0 mLdd H2O溶解,根据开始的pH用2M Na OH或者2 M HCL调pH到8.0,调好pH再定容到1升洗脱?夜(eluti 0 n buf f er) ： 20 1 1年做蛋白纯化时用Na 3PO 8 .2 g (5 0 mM)NaC l 17.5 5g(30 0mM咪口坐1 7 .02 5 g(25 0 mM)加80 0 mLd d H2O溶解,根据开始的pH用2M NaOH或者2M HCL调p H到8 . 0,调好pH再定容到1升)PrepEas

12、e?H ist i d i n e-Tagge dProtein Puri ?ca t ion Kits - Hi gh Sp e ci ?ci t y8 X LEW B u ff er (Ly s is-Equi librium -Was h Buffer ):(室温保存)pH:NaHPO 4.2H2ONaCldH2 08 . 06.2404 g(4 0 0mM14.0 2 56 g (2 . 4M)定容到100 mL (调节pH: 8. 0)4X E 1 uti o n B u f f er:(室温保存)p H : 8 .0 NaHPO 4, 2H2 O 3.1202 g ( 2 00m

13、M) Na Cl7.0128g( 1 .2M)咪口坐6 . 81 g(1M )dH2 0定容至U 100 mL(调节 pH:8.0)EDT A: (10 0mM)EDTA dHI2 0NiSO4： NiSO4 .6H 2O2d H20溶菌酶：(使用时1ml溶液参加 粉末50 mgd dH202.92 3 g定容到100 mL? .6 2 8 5 g( 1 00nM) 定容到100 mL2 0 u 1 )1 m L四利用His- t ag从细胞中富集蛋白配方磷酸钠缓冲液按图示比例混合0. 2 M Na 2Hp Q溶液和0 .2 MNaH 2 P.溶液,得到两种缓冲液,pH分别调节成为8.0和6.

14、 3.pH0 .2 M N&HPQ体积/mL0.2 MNaHzPO 体积/mL6.311. 2 538.758 .047.352.65细胞裂解液最好新鲜配制,当天使用Ce ll 1ysis b uffer终浓度配1 0 m1配 1 5ml配 20ml配 40ml配 30ml盐酸月JK g6M5. 73188.59771 1.46 362 2. 927217. 19 54T r is(g )10 mM0 . 01 21140.0181 7 10.0242280.048 4 560.036 3 42p H 8.0 b uffer(m 1 )100 mM57 .5102015注意月瓜盐是有害

15、试剂注意这里用的磷酸钠缓冲液p H必须8.0!注意二价阳离子螯合剂,复原剂,会导致馍从树脂上的洗脱本实验的所有试剂中 EDT驱度不彳#超过1 mM,DT璐度不超过5mM疏基乙醇浓度不超过 20mMpH 8.0的洗脱溶液最好新鲜配制,当天使用pH 8.0 的 was h buffer终浓度配1 0 0 m l配5 0m1配 20ml配 40 ml配 30mlUre a 尿素(g)8M48.04 824. 02 49.6 0 961 9 .21 921 4 .4144T r i s(g)10 mM0. 1 21140. 06 0570. 0 242280.0484560.036 342p H 8.

16、 0 Na3 Pdbu f fer(ml)100 mM5025102015Tr 1 ton X-10 0 (ul)0.1%(v ol/vol)100502 0403 0b-merc a p toe t hanol.筑基乙醇(ul)5 mM3 517. 571410. 5p H 6.3 w ash buff e r现配现用pH 6.3 的 wash b uffer终浓度100ml配 50ml配 30m lpH 6 .3 的w ash b ufferU rea 尿素(g)8M4 8.04824 .0241 4. 4144Urea 尿素(g)Tris(g)10 mM0 .12 11 40 . 060

17、 570.036342T r is(g)pH6. 3 Na 3P 04 b uffer(ml )100 mM502 51 5pH6.3N a 3P O4 buffe r (ml)Triton X-100(ul)0.1% (vol/vo1)1 00503 0Trit o n X-100 ( u 1 )注意使用pH为6. 3的磷酸缓冲液,而且pH不得低于6,pH要精确配制,非常重要！ Hist i d ine 的质子化,会导致馍树脂上的解离,所以要精确测定pH,并且以p H试纸校对,而不是仅仅依 靠pH仪器.洗脱溶液2 00mMImida z o 1 e 咪口坐,5 % (wt/vol ) SDS

18、 , 150mM Tris-HC 1 (pH 6.7) 30% (v o l/vol)丙三醇720 m M前基乙醇0.0 0 25%(w t /vo 1 )澳酚蓝注意wt/vol是质量/体积之比例,而vol/vo 1是体积：体积的比例.五双向电泳溶液配制水化上样缓冲液I:尿素(8M)CHA PS(4%)D T T ( 6 5 m M)Bio- L yte 0 . 2 % (w/ v )澳酚蓝0.0 0 1Mil 1 i Q水4.805g0. 4 g0 . 0 98g现加50 140 % 现加10 I 1 %澳酚蓝定容到10mI,分装成10小管,-20度冰箱保存上样缓冲液(II):尿素(7M)硫

19、月(2 M)CHAPS(4%)D TT(6 5 m M)B i o -Ly t e0.2% (w澳酚蓝0.001%Mill i Q水4.2g1 .0.4 g/v )10.098g现加50 I 40% 现加I 1%澳酚蓝定容到10 m I,分装成1 0小管,-20度冰箱保存503g1 . 52g0. 2g0 . 2g0 .098g(现加)I(4 0 %现加)上样缓冲液I II尿素(5M) 硫月尿(2M)C H A PS( 2 %)SB 3-10 (2%) DTT(65 m M ) Bio-L y te0.2% (w/v)澳酚蓝0 .001%Mil 1 iQ 水10 11%澳酚蓝定容到10ml,分

20、装成10小管,20度冰箱保存平衡缓冲液母液尿素(6M )SD S (2%)Tris-HC I(pH 8 .8)0.375 M 甘油(2 0%)Mill i Q水3 6 g2g25mI(1.5M)2 0m I定容到10 0ml,分装10管,20度保存胶条平衡缓冲液I 充分混匀,用时现配胶条平衡缓冲液母液1 0 mlDTT0.2g胶条平衡缓冲液II充分混匀,用时现配胶条平衡缓冲母液10mI碘乙酰胺低熔点琼脂糖封闭液低熔点琼脂糖0. 5 %Tr i s25m M甘氨酸1 9 2m MS DS0.1% 澳酚蓝0.00 1 %MilliQ 水0.25g0. 5 g0.30 3 g1 .4 4 g1mI(

21、10% S DS)10 0 I(1%澳酚蓝)定容到1 00mI,加热溶解至澄清,室温保存六同位素实验相关试剂BERrea c tion bu f f er (10ml,分装于-2 0 度)分子量配10m l母液称取终浓度H e pes- K O H(pH7 . 8)2 3 8.311M 称 2 .38 3 1g0.4mI40mMKCI74. 5 51.4 M称 1 . 0437 g0. 5m I70 mMDll15 4 .251M 称 1 . 542 5 g10 I1mMED TA 2Na3 7 2.231M 称 3. 7 2 2 3 g5 I0.5mMM g CI 2 -6 H2O2 0 3

22、. 301 . 4M 称2. 8 462g5 0 I7mMATP1 0 0mM0.2mI2mMd CIH2O8 .8 35m I2Xl i g ase I act i v i t y buf f e r终浓度母液配10ml取H epes(pH7.5 )6 0 mM1 M0. 6mlKCl60mM1M0. 6 mlMg CI2 6H2.1 6 mM1 M0. 16mlDT T2mM1M0.0 2 mlBSA2 0 0 g /ml2 mgddHMO至 10ml2 X Anneali n g b u f ferT ris HCI( p H7 . 5-8.0 )20 血NaCI100nMEDT A2m

23、M2X同位素反响 b u ffer(po 1 y m era s e b e ta聚合反响)终浓度母液1 0 mlTri s -H C l10 0mM (pH 8.0 )1M1 m 1MgCb 6 H2 O2 0mM1 M0.2 m 1DTT4mM1M0.04 mlNaCl4 0mM4 M0 .4 ml甘油20%2 m 1d dH2O至 10ml2X APE1活力鉴定 b u ffer终浓度母液配 10mlT r ls HCL ( pH8. 0)100mM1M1mlKCl6 0mM1M0. 6 mlMgCl2 - 6 H2O10mM1M0. 1 ml甘油20%2m ld d H 2O至 10m

24、l同位素电泳上样 buff e r(2X) (10 0 ml)终浓度取甲酰胺染料90%9 0 mlED TA- Na230 mvt_ - 211 1 . 6 69g X 1 0澳酚蓝1 7 kd0.02%0. 0 2 g二甲苯盅0 .02%0. 0 2g1 0 X TBE buffe rTri s0. 8 9M2 6.94 5 g硼酸(pH8.3)0.8 9 M1 3.757gNa 2 ED TA20mM1.86115g1 5 % Denat ure d DNA PAG E ge 1 ( 1 00m l)10 X TBE15ml40% ,19:1 g e l st o ck 37.5 mldd

25、H2O16mlUre a48g存放在4度,使用前加 200 l 1 0%A济口 20 l TEM ED20% Denatured DNA PAGE gel10 X TBE1 5 ml4 0%,19: 1 gel stock 50mlddH 2 O3. 5mlUr ea尿素48g存放于4度,使用前取35ml混合液加140 l 10% AP和140 1 TEMED硼氢化钠1M3 7.83粉末0. 7566gd d H 2O10m 12 X dRP bu f fe r 分装保存于负 20度分子量母液终浓度配 10mlHepespH7.5 2 3 8 .311M100mM1mlMgCl2 6H2O2

26、0 3.3 01M20m M0 . 2 mlKC17 4.5 51M40mM0.4m 1DTT1 54. 2 51M4mM0.04 mldd H 2O8.3 6 mlDNA b in d i ng bu f fe r终浓度母液分子量配 250mlTris- H C IpH8. 0 50mM1M12.5N a C 11 00mM58.31. 4625gMgCb - 6H2O1 0mM2 03. 30 .5 1 gGl y ce r 0 l1 0 %25mlNP-4 00. 1 %0.25ml(七)酶切打质谱相关配方NH 4H8 3(7 9 .06) 100mM粉末 0.79 0 6gddH2.定

27、容到 10 0ml, p H 7. 8- 8 .0DTT(154.25 g )1 0 0 mM粉末 0.0 1542gddHaO1 mlIAA (碘乙酰胺,1 8 4 .96) 200m M粉末0.0 3 6 992gd d H 2O1ml八其他配方分子量终浓度称取NaCI58. 52 8 0mM1 .6gKC I7 4.5510mM0. 074gNa2HP O414 1 .961.5 mM0 .02 1 g葡萄糖1 8 0.0612mM0. 2 1gHEPE S238 . 3150 mM1 .19gdd H20定容到80ml2XHE P E S缓冲液潘老师给的配方做细胞转染 ,需要调pH为7

28、. 0 5,用0.22 M滤菌, 分装存于20度.潘老师给的配方做细胞转染CaCI2 2H2O (2M)147.02粉末5.88gddH2 O20ml0. 2 2 m滤菌,分装存于20度5XT B S (1 L体系)(在利用flag tag带磁珠的抗体富集蛋白时用)Tr i s HCI( 2 50m M)30. 2 7 5gNa C I (750 mM)43. 8 7 5 gdd H2O定容至1L (调节pH为7. 4)MMS 甲磺酸甲酯(S i gma 密度为 1.3g/mI,M=110.13 )1M 体系：液体 85 I ddH2O 915 IHoch e s t母液：1mg/ ml ,避光存于-2 0度工作液：母液按1:1000稀释Tr itonX - 1 00 ( 0. 2 %)Tri ton X-1 0 02 ldd H2O1ml2 X HDM bu ffe(II) 曾用于LSD1去甲基化终浓度母液配10ml取Tr i s(pH8.5 )10 0mM1 M1mlKC l1 0 0mM1M1 m lMgCI2- 6H 2O10 mvt1M0.1mlBSA1%0. 1 g甘油5%1mlddH2O6 . 9 ml100mr