毕赤酵母表达系统资料整理

1、毕赤醉母表达系统 之答禄夫大创作创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日Mut+和 Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶一一AOX1及AOX2细胞中大多数的醇氧化酶是 AOX1基因产品，甲醇可紧密调节、诱导AOX1 基因的高水平表达， 较典型的是占可溶性蛋白的 30蛆上。AOX催 因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡 萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍缺乏以使 AOX1基因达到最低水平的表达，诱 导物甲醇是AOX1S因可辨表达水平所必须的。AOX1基因已被分离， 含AOX1启

2、动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表 达。AOX2®因与AOX1基因有97%勺同源性，但在甲醇中带 AOX28 因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型 可分离Muts菌株。在YPD（B母膏、蛋白月东、葡萄糖）培养基中， 不管是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲 醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。菌株 GS115 X-33、KM71 和 SMD1168勺区另U创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日

3、GS115 KM71和SMD1168?是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受 体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后 有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115 KM71 SMD1168在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载 体上携带有组氨酸基因，可抵偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变成组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+,重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是 Mut+,也可能是Muts（载体取 代AXO1S因），可以在 MM 口 MD§养基上鉴定表型。SM

4、D116和GS115 类似，但SMD1168s因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷 型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于 MUH表示型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在不含精氨酸的培养基中不克不及生长。用野生型ARG4基因（约2kb）拔出到克隆的野生型 AOX1基因的BamHI（AOX1®因15/16密码子） 及SalI（AOX1基因227/228密码子）位点，取

5、代了 AOX1基因16-227 密码子，此结构转化至 KM71亲本菌（arg4his4）中，分离发生 KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被 aox1:ARG4结构所取代，所以 KM71所有转化子都是 Muts表型。AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取 代方法替换aox1:ARG4结构，这样重组菌株的表型是 His+MutsArg-,这意味着重组菌株生长时需精氨酸。但仅添加精氨酸其实不克不及完全缓和 arg4突变的影响，arg4菌株在含精氨酸 的最小培养基中不克不及很好地生长。因此不推荐在KM71中通过取代aox1:ARG4结

6、构来获得 His +转化子。一般来说，如果是胞内表达，应尽量用 Muts细胞，这样得到 的蛋白产品中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多，使下游纯化更易进行。而对于分泌蛋白的表达， 无论是甲醇利用慢(Muts) 还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用。基因重组Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组， 将外源基因表达框架整合于染色体中以 实现外源基因的表达，包含启动子、外源基因克隆位点、终止序列、 筛选标识表记标帜等。细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程 的难点，因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常 低，所以重组转移载体必须用

7、特定的限制性内切酶进行线性化处 理。这种处理的目的是防止随机拔出重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活，让同源重组以指定的方式发生。表达载体主要分为以下几类：（1）胞内表达载体主要有 pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWOIQ pGAPZ、 pGAPZa（Invitrogen）等。该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以防止毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不克不及被糖基化相关 基因的表达；（2）分泌型表达载体主要有 pPIC9、pHIL-S1、pPICZ%、 pYAM75嘴。由于毕赤酵母自己的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白 分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积

8、累。经常使用的分泌的信号序列主要是由 89个氨基酸组成的交配因子（ -factor） 的引导；（3）多拷贝拔出表达载体如 pPIC9K, pPIC3.5K。在某些情 况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量。该载体均可用于在体内（pPIC3.5K, pPIC9K）或体外（pAO815）发生并分离多拷贝拔出，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋 白表达量。体内整合可通过高遗传霉素抗性筛选可能的多拷贝拔 出，而体外整合可通过连接发生外源基因的串联拔出。在GS115中筛选His+Mut+转化子：用SalI或StuI线性化质 粒转化GS115后，大多在His4位点上发生重组，大多数

9、转化子是 Mut+表型；然而由于质粒含有 AOX1基因序列，有可能在AOX1位点 发生重组，破坏野生型 AOX1基因，发生His+Muts转化子，则需要 在MW MMff板上检测可证实 His+ Mut+转化子。线性化酶切位点拔出事件GS115表型KM71表型SalI 或 StuI拔出his4His+Mut+His+MutsSacI拔出5AOX1His+Mut+His+MutsBglII取代AOX1His+MutsHis+Muts(不推荐)毕赤经常酵母表达使用培养10XYNB(13.4%勺无氨基酸酵母氮源 )，134gYNB固体溶于1L蒸储水，过滤灭菌，4c保管。YPD完全培养基：酉母提取物1

10、0 g/L ,蛋白月东20 g/L ,葡萄糖20g/L(固体培养基含1.5%琼脂)。转化培养基 RDB每100mL加入山梨醇 18g(186 g/L)，琼脂糖 2g(20g/L)121c灭菌20分钟，然后待温度降至 60c以后在超净台 上加入 10X YNB10mL(13.4 g/L) , 10X葡萄糖 10mL(20 g/L) , 500X 生物素0.2mL(4X10-4g/L) , 100X AA 1mL混匀，倒平板 (灭菌时 只加入80ml水即可)。选择培养基 MD(t小葡萄糖)：配100mL向80mL水中加入琼脂糖 2g(20 g/L)121 C灭菌20分钟，待温度降至 60c以后在超

11、净台上 加入 10X YNB 10mL(13.4 g/L) , 10X葡萄糖 10mL(20 g/L) , 500X 生物素 0.2mL(4X10-4g/L)。选择培养基MM最小甲醇)：配100mL向90mL7k中加入琼脂糖2g(20 g/L) 121 C灭菌20分钟，待温度降至60c以后在超净台上加入10XYNB10mL(13.4 g/L) , 500X 生物素 0.2mL(4 X 10-4g/L) ,0.5mL 甲醇(0.5%)。诱导表达培养基 BMGY配1L,酵母提取物10 g/L ,蛋白月东20 g/L , 3g/L K2HPO4, 11.8g/L KH2PO4 ,加水至 890mL

12、121c灭菌 20 分 钟，然后待温度降至60c以后在超净台上加入 10X YNB100mL(13.4 g/L) , 500X 生物素 1mL(4X 10 -4g/L),甘油 10mL诱导表达培养基 BMMY酵母提取物 10g/L ,蛋白月东20 g/L , 3g/LK2HPO4 11.8g/L KH2PO4 力口水至 895mL 121c 灭菌 20 分钟, 然后待温度降至 60c以后在超净台上加入 100X YNB 100mL(13.4 g/L) , 500X 生物素 1mL(4X 10-4g/L),甲醇 5mLBMGY/BMMY酵母浸出物及蛋白月东，可稳定分泌蛋白，阻止或减少 分泌蛋白的分解。如果目的蛋白对中性PH蛋白酶敏感的话，可在无缓冲培养基(