Snapshot技术平台(中文)

1、精心整理Snapshot技术平台SnaPsho肢术平台是Applied Biosystems,AB公司推出了专为检测 SNP设计的分 析软件和试剂盒可对多个 SNP位点同时进行基因分型，也被称为 minisequencing。该方 法针对不同突变位点设计不同长度的引物 SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五 色荧光检测、Gene mapper分析，可在 一次电泳胶 内检测 多个SNP位点。这个平 台是建立在3730, 3130等PCRW序仪上的技术。3730XL型DNA序歹I1检测仪一.？ SnaPsho正作原理应用SNaPshot进行定点的序列分析，其基本原理遵循了 DNA直接测序中的

2、双脱氧终止法，所不同的是PCR反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个SNP精心整理精心整理位点的引物3'端都紧靠SNP点，因此每一种引物在聚合酶作用下 根据模板的的序 列，只延伸一个核甘酸。然后用先进的荧光检测系统，检测延伸的那个核甘酸的种 类。1 .多重SNaPsho坂应的工作原理：在一个SNaPsho坂应体系中， 针对每个待测SNP位点 在其上游或下游设计一条单向的寡核甘酸引物（正向引物或反向引物），引物的Tm值要求在50度以上，在AmpliTaq聚合酶和4种不同荧光标.记的ddNTP 存在的情况下，各条引物与各自互补的DNA模板结合，聚合酶在引物的3'末端延伸单 个

3、碱基反应即告终止，产物的长度为引物长度+1bp。延伸的碱基就是该样本在该位点上的基因型，其中纯合子表现为单峰，杂合子表现为双峰。为了能够分辨不同SNP的不同基因型，可在引物的5'末端加上不同长度的Poly C或Poly T,使各条引物以长度区分。经电泳将 其分开。最短的引物一般设定为 20bp,相邻两个SNP的引物之间长度一般相差 4-6 个核甘酸，以便区分。多重SNaPshot反应即利用引物间长度白差异和单碱基延伸4种荧光标记的ddNTP而最终达到区分不同SNP位点的作用，一次反应可以同时对4-5个SNP进行基因分型，是 一种通量较高的基因分型的方法。图1 SnaPshot实验原理图

4、解2 .多重SNaPsho阪应的工作通量工作的进度取决于多重 PCRffi EXTENSION）条件优化过程。还有测序仪的通量也是 很重要的，3730每天可以做16次96道电泳，如果每次出4个位点，那每天的通量 就是6000个GENOTYPING是中等通量的检测。二.？ SnaPsho正作流程精心整理精心整理1. 引物的设计SNAPSHOT1以检测多重的SNP,我们一般选择45个位点做一个组合。现对这些 目的SNP进行引物的设计。每个SNP设计3条引物，其中2条是目的片段的扩增， 长度在200500bp左右，Tm值在60度左右。第3条的引物的是延伸ddNTP设计在 SNP位点的上游或者是反向的

5、下游。引物设计注意事项：1. 同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差4-6个碱基。2. 引物与模板互补部分(有效引物)的 Tm值至少要50 C。3. 为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的5端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC成者poly(dGACT尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成二 级结构，并且都经过实验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因3端的 poly(dA)尾巴互补。4. 引物在毛细管中的迁移受引物长度、碱基组成、标记的荧光染料等因素影响。引物越短，影响越显着，越有可能偏离仅仅根据片段长度预期的引物迁移距 离。当引物长度小于36个碱基时

6、，ABI强烈建议用户使用Primer Focus试剂 盒做预实验，确定各种引物在多重电泳中的精确迁移距离。5. 合成长度大于30个碱基的引物时，建议采用 HPLC方法纯化。6. 在引物设计的时候，如果 领DNA的序列不理想，难以设计出最佳引物，请使用-链DNA设计引物。进行多重SNaPshot反应时，需多条引物和多个模板同时进行。为了保持反应的一致性，对引物的设计要求是尽量保持相近的 Tm值，否则会引起非特异性产物的扩增 造成碱基误读。另外，反应混合液中不同模板和其对应引物的量还应选择合适比例。与单重SNaPshot反应相比，多重反应不但节省了反应时间，还大大减少了试剂用量，降低了反应成本。位

7、占八、SNP1PCR LEFT PRIMERTMPCR RIGHT PRIMERTM长度SNP1c/tGAGCCAGAGGAGGATG；TTG35GGCTAGAAGGAGCGCTAG03A2248SNP2C/TACGTTGCAGTTGCCTTT(59192GACTCTGCAGTGAG(TAGCCC5210SNP3A/GCCTTGATACCACGTGCV59O9TTCTTCAGCCTCTGCTTC59T96185SNP4C/GTCAAGCCCAGTCCTTTC侬184CCCAATAGCCGTATCAA:TGO2296位占八、延伸引物TM方向产物长度Ntsadde dSNP1CGATCATAGTC

8、AGCTGGCCT60.4R20A/GSNP2cccccccc-GGCACGGTACCTGGGCT:62.1L25C/TSNP3cccccccc-TCATCAATTGCTGAGGACAGAG；60.4L30A/GSNP4ccccccccccccc-AACTCTGGGAGATTCTCCTGACTAT 60.36L38C/G2. 片段扩增引物稀释，将2OD的引物稀释到100mM.I加入的TE的量为660000/MW如分子量为7003,则加入660000/7003=94.2ul做试验前将一组的引物加 DDH2O稀释成10mM.反应体系：10X Buffer (15Mm Mg)1 LPrimer (1

9、0Mm)0.4 LdNTP(10Mm) 0.3 L精心整理精心整理HotStar (5u/ul)0.1LDNA1 LMg" (25Mm)0.52LddH2O6.68LTotal Volume10 L多重PCR£应采用Touchi- down的PCRS应程序：95 C 15 min;94 C40 s, 63 C1 min 每个循环下降 0.5 C ,72 C1.5 min,1 5 个循环；94 C40 s,56 C40 s,72 C1.5 min, 25 个循环；72 C 8 min;结束后4 C保存。PC*物经琼脂糖电泳检测有片段的表明实验成功。多重PCR产物凝胶电泳3.

10、PCR产物的纯化多色SNP实验的模板DNA可以是质粒，也可以是PCR产物(0.01到0.4 pmol)。质粒可以直接用于反应，但PCR产物必须先作好纯化，SAP酶将残余dNTPs去磷酸化，ExoI 降解游离单链引物。(1)纯化酶：SAP 和 Exo I(2)作用原理：SAP去除多余的dNTP和弓I物Exo I去除单链引物和其他单链DNA产物(3)反应体系：PCR产物6 L+2 L酶混合液(含2U SA对2U ExoI ),振荡混匀(4)反应条件：37 C孵育保温1 hr,然后75 C保温15 min以灭活SAP和Exo I酶。纯化好的模板可以在4 C保存24 hr或-20 C长期保存。4. S

11、NaPshot PCR混合模板：如果以PCRT物彳乍为SNaPshot PCR勺模板，在纯化好后，每种各取2 L, 混合。混合SNaPshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2 M。混合SNaPshot!PCR弓I物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为 0.2 M。(每个SNP引物加1-2ul至U500UIDDH2O 中)SNaPshot PCR用量 (L / Sample师准品 (L)Reaction Mix0.55Pooled PCR Products 22精心整理精心整理精心整理Pooled Primers1.21dH2O1.32总体积5""Lio

12、lPCRB环条件为：96 C 10 sec (96 C 10 sec 50 C(53 C)5 sec 60 C 30 sec) 25 循环 60 C 30 sec 4 C5. SNaPshot PC产物的纯化在5 L上述SNaPshot PC%物中加入0.5USA破者1 U CIP震荡¥M匀，37 C保 温1 hr, 75 C保温15 min以灭活酶，4 C可保存24 hr或-20 C长期保存。6. 310、3100、3730电泳样品制备试齐1用量(L)Hi-Di Formamide9.25GS-120 LIZ0.1SNaPshot1总体积10.35L95 C变性5 min 迅速冰冷4 min。每个电泳样本都加入了 LIZ120内标，使延伸片段的长度大小可以精确定位。15 20 2535506280110120图2, liz-120分子内标电泳峰形7. GeneMapper4.0软件分析图3.不同样本多重 SNAPSHOTt泳结果图4. 1个SNP位点的不同样本白基因型结果，G/A,AA,GG软件分析后输出数据结果Sample NameMarkerAllele 1Allele 2LH005RS1010GLH006RS1010GALH007RS1010ALH009RS1010GALH010RS1010GALH012RS1010GLH014RS1010GALH017R