RT-PCR原理和实验步骤

1、实用文档RT-PCR原理与实验步骤一、知识背景：1、基因表达：DNA *RNA Protein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因一M0 4个丝心蛋白mRNA （每个mRNA存活4d ,可以合成105个丝心蛋白） 一共合成109个丝心蛋 白。因此单拷贝基因的 mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR技术（Polymerase chain reaction）:即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核甘酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：A.变性：通过加热使 DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA;B

2、.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C.延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2+存在下，退火引物沿 5'*3方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase ）是存在于 RNA病毒体内的依赖 RNA的DNA聚 合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以 RNA为模板合成cDNA第一条链；2、Rnase水解活性：水解 RNA:DNA杂合体中的 RNA;3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条 DNA链为模板合成互补的双链 cDNA.二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其

3、原则：1）引物的特异性决定 PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至 关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚 型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的 hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择 覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不 存在的内含子。2）引物设计原则的把握引物设计原则包括：a、引物长度：一般为1530bp ,引物太短会影响 PCR的特异性，引物太长 PCR的最 适延伸温度会超过 Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嗯吟或喀咤的聚集存在，特别是连续出

4、现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40%60%, PCR扩增的复性温度一般 是较低Tm值减去510度。c、3'端要求：3'端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是 A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3'端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的 Tod、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或 引物自身复性。e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3'端不应超过2个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。

5、g、5'端无严格限制：5'末端碱基可以游离，但最好是 G或C,使PCR产物的末端 结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0 , Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过 0.1%DEPC水浸泡处理，除去 RNA酶，防止操作过程中 RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活 DEPC）。3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。三、RNA的提取方法RTPCR中从细胞分离的 RNA的

6、质量至关重要，包括 RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少 RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广 泛，除细胞内源性 RNA酶外，环境中也存在大量 RNA酶。因此在提取 RNA时，应尽 量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性 RNA酶污染和抑制内源性 RNA酶活 性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白 Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫鼠酸月瓜抑制内源性RNA酶。文案大全RT-PCR 步骤:1. RNA的提取.约对个SI用加OMI变性海反复取打“0-，0次50- -00mg组织加0一8加变性液辐比 生郁人EP管内加。乙瞄

7、九。5ml水饱和酚j 0 2ml氟仿,充分混匀，醺置5分钟后，硝7 1280gX20minu小心将上层无色液体移入新EP管内,切勿取到卬昙日色物质（取3口即可U对于脂用、醉夏多的组织择品可以再加水馆不宣和氧仿再提取一;也靖高甄度jj加等怵也用丙醵，捶轻筋喇浸匀，-20七肺置虬inU4匕l2000gxi0mino可看到管底部壁二有白色沆企即为RMA,弃去上清加03伸支性盗和"门房丙整重新悬起沉淀，-2。1tt欣里国mm 4 tJ2000gXIOnin口界去上洁，加imi75Mzi背" 吹打易起况送，室温绛贵万mn £可二。七 保存）4 t 7500g X 5min,

8、笄上清，天阂'滤纸U一加适里42口山左右）DEPC处理过的水，澹弹BNA （PT-20七保存）,取NUI稀释5口倍，于核酸蛋白;则定Smin了min29 cycles3ul(10mM)lullul( lumoi t) lulf lumol 1) 1.5ul36.7U10.EK2.41；)50ul，cDNA的合成，逆转录体系的组成DEPC处理水8ul10mM dNTPs2.5ulRandom primers0.4ulRNasin0.5ul忌、RNA2.5 -3usc70'C 5minn速置冰水中冷却u再加=5*逆转录buffer5ul逆转录酶lul(200U) 加水至25ulu3

9、7 "C 60mhi90 IC 5min3、PCR扩增：50111PCR体系的组成：lOxpCRbuffer5ulMg Cl： lOmMdNTPssense primer antisensi? primercDNA DEPC处理水 Taq 酶4. PCR反应条件±94 r94 V退火温度72 <!72 r4 t四、PCR条杵的优化：PCR条件的优化主要是引物退火温度的调节，一散在引物设计软件推荐温度的上下 :C变化寻找最佳退火温度，此外M一浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2mM左 右.引物和模板的量等。五、产物的电泳和结果的测定，根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖截

10、胶（不同长度产物所需凝胶浓度）取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样干事先做好的琼脂糖硬胶点样孔中. 1.0V cm电冰45 - 60mih。成像系统成像分析&分离不同大小D、A片段的合适琼脂糖裱度琼脂糖浓度（%）线性DNA片段的有效分离范围（kb）0.50.71.01.21-300.8 - 120.5 - 100.4-70,2-3六、需注意的问题：1 .注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：氯仿、漠化乙锭（EB）、酚、异硫氨酸服、紫外线等2 .注意避免试剂污染3、始终注意避免RNR酶的污染：4.保管好自己专用的试剂，公用试剂保管好，相互协调，注意卖验室卫生RNA的琼脂糖凝胶电泳

11、实验原理和步骤来源：生物谷 访问量：3688评论(0)分享1一、实验目的掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。二、实验原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用 1.0%-1.4% 的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的 条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定 RNA分子 量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。'rRNA （占8085%）18s5S植物RNAtRNA及小分子RNA （占1015%）'inRNA （占1 5%）V?V?,bbiQQ,G

12、Qip寡聚脱氧胸甘（OligodT）层析柱三、实验材料、器具及药品蘑菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉， 紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5pg/m限化乙锭(EB) 10X载样缓冲液。四、实验步骤(1)用1XTAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1XTAE电泳缓冲液至液面覆 盖凝胶。(2)在超净工作台上，用移液器吸取总 RNA样品4仙山封口膜上。在实验台 上再加入5仙11XTAE电泳缓冲液及1膜的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入 点样孔。(3)打开电源开关，调节电压至100V,使RNA由负极向正极电泳，约 30min后将凝胶放入EB染液中染色5

13、min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪 上观察RNA电泳结果。1% DenMturint;注部esc Gd of Total RNALan* Li Blfh QuuIMt Tatikt RNALaiw 3: Pvtj DcpWl T«im1Lam MIhtcrmTZR55RNA的变性琼脂糖凝胶检测试齐I：(1) MOPS 缓冲液(10*) :0.4mol/L 吗咻代丙烷磺酸(MOPS) (Ph7.0), 0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA 。(2)上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4% 澳酚蓝，0.4%二甲苯蓝c(3)甲醛。(4)去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净(一般浸泡过夜) 水冲 洗乙醇干燥3%H2O2灌满室温放置10分钟0.1%DEPC水冲 洗。操作：(1)将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。(2)配制琼脂糖凝胶。称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml锥形瓶中，加入40ml蒸储水，微波炉内 加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶凉至60-70 C,依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和 0.