酸溶蛋白和粗蛋白测定

1、.油脂的检验与分析粗蛋白质的测定（凯氏半微量定氮法）1 / 4.测定原理凯氏法的基本原理是将含有蛋白质的样品与浓硫酸共热使其分解，其中氮元素变成铵盐。 再经浓碱液作用， 放出的氨气经硼酸吸收后用盐酸标准溶液滴定硼酸溶液所吸收的氨。计算出试样含氮量，乘以相关的蛋白质换算系数，即得打蛋白质的含量。消化：蛋白质与浓硫酸混合加热，蛋白质被炭化分解，其中碳被氧化成二氧化碳，所含的氮则转变成硫酸铵残留于消化液中。有机物（含 N 、C、H 、O、 P、 S 等元素） +H2SO4CO2 (NH 4)2SO4H3PO4SO2 SO 3由于上述反应进行的很慢， 消化需要很长时间， 加入催化剂可加速反应。 硫酸铜

2、是备用的催化剂，硫酸钾能提高硫酸的沸点， 常将它们混合使用， 起加速氧化、 促进有机物分解的作用。蒸馏：消化所得的硫酸铵加碱蒸馏，氨就被释放出来。(NH 4)2SO4 2NaOH 2 NH 3· H2 O Na2SO4NH 3·H2O NH 3 H 2O生成的氨用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后，指示剂颜色变化，再用盐酸滴定，直至恢复到原来的氢离子浓度为止，盐酸与样品中氨是等摩尔反应。2NH 4HBO(NH 4 )2 B 4O7 5H2 O333(NH 4)2 B 4O72 HCl 5 H2O 2NH 4Cl 4H 3 BO 3由于各种蛋白质的含氮量通常为16左右，将含氮量乘以蛋

3、白质系数，即为粗蛋白质含量。试剂 浓硫酸过氧化氢水混合液 （ 23 1）。在 100mL 水中缓慢加入浓硫酸200mL ，1冷却后加入30过氧化氢 300mL ，混匀备用，此液存放阴凉处可保存一个月。2混合催化剂。10g 硫酸铜（ Cu SO4·5H2O）、100g 硫酸钾、 0.2g 硒粉，在研钵中研细， 通过孔径0.45mm筛，混匀后备用。340g/100mL 氢氧化钠溶液、 2硼酸溶液、 0.01mol/L盐酸溶液。 甲基4红乙醇溶液： 称取 0.1g 甲基红置于研钵中，加入少许95乙醇， 研磨溶解后加入75mL95乙醇。5 次甲基蓝乙醇溶液：0.1g 次甲基蓝溶于80mL95

4、乙醇中，临用时将以上两液按2：1 比例混合即成。在酸域呈紫红色，PH5.5 时无色，在碱域呈绿色。仪器 50mL 凯氏烧瓶、 1000mL 圆底烧瓶、 100mL 锥形瓶、 5mL( 刻度 0.01mL) 微量滴定管、 50mL 容量瓶、 5mL 移液管、凯氏蒸馏装置。2 / 4.操作方法1消化。用长条光滑纸称取试样0.2 0.3g，精确到0.0001g（约含粗蛋白质 10 30mg）直接送入凯氏烧瓶底部，加混合催化剂 1g，同时加入硫酸过氧化值水混合液 3 5mL ，稍加振摇，斜置于电炉上。在通风橱内加热进行消化。开始时用低温加热，切勿使瓶中泡沫超过瓶肚的2/3，待泡沫减少和烟雾变白后再增加

5、温度保持微沸。直至消化液呈浅蓝绿色的透明状时再继续加热沸腾10min ，取出，待消化液冷却至室温后，加水至10 20mL。溶液温度降到室温后，将消化液移入50mL 容量瓶中，并用少量水将凯氏烧瓶冲洗 3 4 次，洗涤液一并移入容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀备用。8 蒸馏。凯氏微量蒸馏装置它是由蒸汽发生器、反应瓶、及冷凝管等组成，在大烧瓶2（容量 1000 mL）中加入蒸馏水400mL 和少量碎玻璃片，加 5 滴混合指示剂，加几滴酸液，使水呈紫红色，盖紧瓶塞，连接4、 1、 2 并检查有无漏气。量取30mL 2硼酸溶液，注入（100mL ）三角瓶 3 内，作为承接器，加混合指示剂1 2 滴（溶液

6、呈紫红色） ，置于冷凝管2 下面，使管尖端插入硼酸溶液1cm深处。用 5mL移液管吸取 5mL（ V）试样稀释液，由漏斗5 注入蒸馏瓶 1 内，再倒入蒸馏水10mL冲洗漏斗5。接着量取 40g/100mL 氢氧化钠溶液10mL，由漏斗 5 注入蒸馏瓶1 内，再用2 5mL水冲洗漏斗 5，旋紧活塞，此时蒸馏瓶1 内溶液总体积应不超过容积的一半。打开电炉加热烧瓶8，打开簧夹7，关闭活塞6，使蒸汽通过回流管 4 进入蒸馏瓶1 再由蒸馏瓶 1 经冷凝管 2 而流入三角瓶3，待三角瓶3 内的溶液呈绿色时， 开始记录时间， 经 23min 后, 将三角瓶 3放低，使冷凝管2 下端离开液面，继续蒸馏1min

7、，然后用少量无CO2蒸馏水冲洗冷凝管 2 下端，蒸馏即告结束。蒸馏结束后，旋紧簧夹7 断绝蒸汽。这时由于回流管4 内蒸汽压立即降低，所以蒸馏瓶1 内的液体则全部吸入回流管4 内。然后打开漏斗5 下的簧夹，注入蒸馏水40 50mL 于蒸馏瓶 1 内，关闭漏斗5 下的簧夹，打开簧夹 7，通入蒸汽加热洗涤蒸馏瓶1，再断绝蒸汽，使洗涤回流至回流管4 中，打开活塞 6，将回流管4 中废液弃去，关闭活塞6，为下次蒸汽做好准备。 滴定。用 0.01mol/L盐酸标准溶液滴定三角瓶3 中的吸收液至出现淡紫色为止。记录3所消耗盐酸标准溶液的体积（V 1）。空白试验除不加试样外，消化、蒸馏、滴定操作与样品相同。3 / 4.结果计算粗蛋白质的干基含量按下式计算：（ V 2V 1）· c× 0.0140 × 6.25W（）× 100V m×V式中 V 2-滴定试样时所需标准盐酸溶液的体积，mL ；V 1-滴定空白时所需标准盐酸溶液的体积，mL ；c-盐酸标准溶液浓度，mol/L ；m- 试样的质量，g；V- 试样分解液总体积，mL ；V - 试样分解液蒸馏用体积，mL ；0.0140-与 1.00mL 盐酸标准溶液 c（HCl） 1.000