现代分子生物学试题及答案

1、现代分子生物学习题及答案一、填空题1 基因工程是70 年代发展起来的遗传学的一个分支学科。2 基因工程的两个基本特点是：(1)分子水平上的操作，(2)细胞水平上的表达3 基因克隆中三个基本要点是：克隆基因的类型； 受体的选择；载体的选择4 通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的限制性酶切图谱。5 限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自属名的第一个字母，第二、三两个字母取自_种名的前两个字母，第四个字母则用株名 表示。6部分酶切可采取的措施有：(1)减少酶量；(2)缩短反应时

2、间；(3)增大反应体积等。7 .第一个分离的限制性内切核酸酶是EcoK;而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_ EcoRl。8 .限制性内切核酸酶 BsuRI和Haem的来源不同，但识别的 序列都是GGCC,它们属于异源同工酶。9 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 大片段是用_枯草杆菌蛋白酶切割 DNA 聚合酶 I 得到的分子量为76kDa 的大片段，具有两种酶活性：(1) 5'-3'合成酶的活性；(2) 3'-5'外切核酸酶的活性。10为了防止DNA 的自身环化，可用碱性磷酸酶去双链DNA_ 5端的磷酸基团。11. EGTA是_Ca2+_离子螫合剂。

3、12测序酶是修饰了的T7 DNA 聚合酶，它只有_ 5'-3'合成酶的活性，而没有3'-5'外切酶的活性。13.切口移位(nick translation)法标记 DNA的基本原理在于利用 DNA 聚合酶 I 的 _5'一 3'外切核酸酶和 5'一 3'合成酶的作用。14欲将某一具有突出单链末端的双链DNA 分子转变成平末端的双链形式，通常可采用 S1 核酸酶切割或 DNA 聚合酶补平。15. 反转录酶除了催化 DNA的合成外，还具有 核酸水解 酶H的作用，可以将DNA-RNA杂种双链中的_RNA_水解掉。16. 基因工程中有 3

4、种主要类型的载体： 质粒DNA,病毒 DNA ,质粒和病毒 DNA杂合体。17. 就克隆一个基因（DNA片段）来说，最简单的质粒载体也 必需包括三个部分：复制区：含有复制起点；选择标记：主要是抗性基因；克隆位点：便于外源DNA的插入。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。18. 一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不由质粒，这种现象叫 质粒消除（或治愈）_。19. pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于 pMBl 一它的四环素抗性基因来自于pSCl01,它的氨节青霉素抗性基因来自于 pSF2124（R质粒）。20. YAC的最大容载能力是 1000

5、kb, BAC载体的最大容载 能力是 300kb 。21. pSCl01是一种 严紧 复制的质粒。22. pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 pBR322和M13两种质粒改造而来。它的复制子来自 pMBl, Amp抗性基因则是来自 转座子。23. 噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA的扩增；二是对某些噬菌体（如 噬菌）的遗传结构和功能研 究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详 尽。24. 野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 没有合适的限制性内切核酸酶识别位点 和选择标记。25

6、. 黏粒（cosmid）是质粒一噬菌体杂合载体，它的复制子来自质粒、COS位点序列来自 噬菌体，最大的 克隆片段达到45 kbo26. 野生型的 噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：（1）分子量大，（2）酶的多切点，（3）无选择标记27. 噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是 复制区，而来自噬菌体的主要结构是IG区 。28. 噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的 _75%105%_的范围内。29. 在分离DNA时要使用金属离子螫合剂，如 EDTA和 柠檬酸钠等，其目的是一螫合Mg2+离子，抑制核酸酶的活性30. 用乙醇

7、沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如 NaCl和NaAc,其目的是中和DNA分子的负电荷，增加 DNA分 子间的凝聚力。31. .引物在基因工程中至少有4个方面的用途：（1）合成探针；（2）合成cDNA; （3）用于PCR反应；（4）进行序列分析32. Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是 平末端，而是有一个突生碱基末端的双链 DNA分子。根据这一发现设计了克 隆PCR产物的T一载体。33. 在cDNA的合成中要用到 S1核酸酶，其作用是切除在 第二链合成时形成的发夹环 34. 乙醇沉淀DNA的原理是 乙醇使DNA分子脱水。35. 假定克隆一个编码某种

8、蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：（1）保持正确的可读框（2）能够使其转录的启动子（3）具有翻译的起始和终止信号36. 受体细胞的感受态是 接受外源DNA的生理状态。37. DNA重组连接的方法大致分为四种： （1）黏性末端连 接；（2）平末端连接；（3）同聚物接尾连接；（4）接头连接法。38. 将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个 基因组 DNA 克隆_， 各种此类质粒的集合体称之为构建了一个 基因组 DNA 文库 。39. 将含有一个mRNA 的 DNA 拷贝的克隆称作一个_cDNA克隆 ，源于同一批RNA 制备物的克隆群则构建了一个_cDNA 文库_。40只要知道基

9、因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用_聚合酶链式反应(PCR)可以将这段 DNA进行百万倍的扩增。41人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为0 C 时吸附 DNA,42 C _时摄人DNA。42目前，在重组体的筛选中，已经发展了许多构思巧妙、具有极高准确性的筛选方法。大致可以分为： (1)遗传学方法；(2)物理筛选法；(3)核酸杂交法；(4)表达产物分析法等。43 PCR 扩增筛选重组体是比较简便的筛选方法，它适合于_插入外源片段的种类较多，大小又极为相似的重组体的筛选。44 核酸杂交探针可分为两大类：DNA 探针和 RNA 探针。其中 DNA 探针又分为_基因组DNA 探针和 cDNA 探针。4

10、5如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA 产生5突出的黏性末端，则可以用_ Klenow 酶填补的方法_进行3末端标记。如果用限制性内切核酸酶切割DNA 产生的是3突出的黏性末端，可以用_ T4DNA 聚合酶 进行 3末端标记。46 单链 DNA 探针的标记可以采用下列方法：(1)用 M13 噬菌体载体合成单链DNA 探针； (2)从 mRNA 反转录合成单链 cDNA 探针；(3)用不对称PCR 合成单链DNA探针。47根据Northern 杂交的结果可以说明：外源基因是否进行了转录_。48差示杂交(differential hybridization) 技术需要_两种不同的细胞群体能够表达不

11、同的基因，即在一个群体中能够表达一些基因，而在另一个细胞群体中不能表达这些基因 。49 RNA 分子经凝胶电泳后按大小不同分开，然后被转移到一张硝酸纤维素膜(尼龙膜 )上， 同一放射DNA 探针杂交的技术称_ Northern 印迹_。50在_ Southern 印迹_技术中，DNA 限制性片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上，然后与放射性的DNA 探针杂交。51可用 T4 DNA 聚合酶进行平末端的DNA 标记，因为这种酶具有_5 3 合成酶_和 _3 5 外切核酸酶_的活性。52根据外源片段提供的遗传表型筛选重组体，必需考虑三种因素 ： (1)克隆的是完整的基因；(2)

12、使用的是表达载体；(3)不含内含子。53 Northern 印迹和 Southern 印迹有两点根本的区别：(1)印迹的对象不同：Northern 是 RNA， Southern 是 DNA ；(2)电泳条件不同，前者是变性条件，后者是非变性条件。54放射免疫筛选的原理基于以下三点：(1)抗体能够被吸附到固体支持物上；(2)同一个抗原可以同几种抗体结合；(3)抗体能够被标记二、选择题(单选或多选)1 因研究重组DNA 技术而获得诺贝尔奖的科学家是()(a)A Kornberg (b)W Gilbert (c)P Berg (d)B McClintock2 第一个作为重组DNA 载体的质粒是()

13、(a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl83 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有 ()不太恰当。(a)由作用于同一 DNA序列的两种酶构成(b)这一系统中的核酸酶都是n类限制性内切核酸酶(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰(d)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统4 n型限制性内切核酸酶： ()(a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列(b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供(c)限制性识别非甲基化的核昔酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性(e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供5下面

14、有关限制酶的叙述哪些是正确的?()(a)限制酶是外切酶而不是内切酶(b)限制酶在特异序列(识别位点)对DNA进行切割(c)同一种限制酶切割 DNA时留下的末端序列总是相同 的(d)一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA ,产生黏末端(e)一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA ,产生平末端6.第一个被分离的n类酶是：()(a)EcoK(b)Hind m(c)Hind n (d)EcoB7在下列进行DNA 部分酶切的条件中，控制那一项最好 ?()(a)反应时间(b)酶量(c)反应体积(d)酶反应的温度8.在下列试剂中，那一种可以螫合Ca2+离子？()(a)EDTA (b)柠檬酸

15、钠 (c)SDS (d)EGTA9在下列工具酶中，那一种可以被EGTA 抑制活性?()(a)S1单链核酸酶(b)末端转移酶(c)碱性磷酸酶(d)Bal 31 核酸酶10限制性内切核酸酶可以特异性地识别：()(a)双链DNA的特定碱基对(b)双链DNA的特定碱基序列(c)特定的三联密码(d)以上都正确11 下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是 ()。(a)Sau3A I (b)E coRI (c)hind III (d)Sau 3A112限制性内切核酸酶的星号活性是指：()(a)在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。(b)活性大大提高(c)切割速度大大加快(d)识别序列与原

16、来的完全不同13下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?()(a)甘油含量过高(b)反应体系中含有有机溶剂(c)含有非Mg2+的二价阳离子 (d)酶切反应时酶浓度过低14关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有()不太恰当(a)由作用于同一 DNA序列的两种酶构成(b)这一系统中的核酸酶都是n类限制性内切核酸酶(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰(d)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统15在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA 互补链时应选用 ()(a)T4DNA 聚合酶(b)Klenow 酶(c)大肠杆菌DNA聚合酶I (d)T7DNA聚合酶16末端转移酶

17、是合成酶类，()(a)作用时不需要模板(b)在Ca2+的存在下，可以在突生的3,末端延长 DNA链(c)在Ca2+的存在下，可以在隐蔽的3,末端延长 DNA链(d)上述说法有两种是正确的17在基因工程中，可用碱性磷酸酶()(a)防止DNA的自身环化(b)同多核昔酸激酶一起进行 DNA 的 5，末端标记(c)制备突生的3,末端(d)上述说法都正确18下列酶中，除()外都具有磷酸酶的活性(a)入核酸外切酶(b)外切酶m(c)单核昔酸激酶(d)碱性磷酸酶19 下列哪一种酶作用时需要引物? ()(a) 限 制 酶(b) 末 端 转 移 酶(c) 反 转 录 酶(d)DNA 连接酶20 S1 核酸酶的功

18、能是()RNA(c)切割发(a)切割双链的 DNA (b)切割单链的 夹环(d)以上有两项是正确的21 Klenow 酶与 DNA 聚合酶相比，前者丧失了()的活性。(a)5， -3， 合成酶，(b)3， -5， 外切酶(c)5， -3，外切酶 (d)转移酶22 下面关于松弛型质粒(relaxed plasmid) 性质的描述中，()是不正确的(a)质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数通常带有抗药(b)可以在氯霉素作用下进行扩增 性标记(d)同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子23 基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天

19、然质粒载体很少，在下列载体中只有()被视为用作基因工程载体的天然质粒载体(a)pBR322(b)pSCl01(c)pUBll0(d)pUCl824 下列哪种克隆载体对外源DNA 的容载量最大?()(a)质粒(b)黏粒(c)醉母人工染色体(YAC) (d)噬菌体(e) cDNA 表达载体25 松弛型质粒：()(a)在寄主细胞中拷贝数较多 一般没有选择标记(b)可用氯霉素扩增(d)上述(a)、(b)两项正确26 Col El 是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒：()(a)是松弛复制型(b)具有，四环素抗性(c)能被氯霉素扩增(d)能产生肠杆菌素27 同一种质粒DNA ,以三种不同的形式存在

20、，电泳时，它们的迁移速率是：()(a)OCDNA>SCDNA>LDNA(b)SCDNA>LDNA>OCDNA(c)LDNA>OCDNA>SCDNA(d)SCDNA>OCDNA>LDNA28 pBR322 是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自：()(a)ColEl (b)Ri 质粒 (c)pSCl01 (d)pUCl829关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确?()(a)在不同的宿主中具有不同的复制机制(b)在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点(c)在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶(d)在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率

21、30能够用来克隆32kb 以下大小的外源片段的质粒载体是()(a)charomid (b)plasmid (C)cosmid (d)phagemid31第一个作为重组DNA 载体的质粒是()(a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl832. Ti 质粒： ()(a)可从农杆菌转到植物细胞中(b)作为双链DNA被转移(c)在植物中导致肿瘤(d)介导冠痹碱的合成,作为细菌的营养物和植物的生长激素(e)需要细菌的vir基因帮助转移在植物细胞中作为染色体外质粒33黏粒(cosmid) 是一种人工建造的载体，()(a)它具有COS位点，因而可进行体外包装(b)它具有质粒DN

22、A 的复制特性(c)进入受体细胞后，可引起裂解反应(d)进入受体细胞后，可引起溶源化反应34有两种确定核酸中核苷酸序列的方法：化学序列分析法(Maxam-Glbert)和酶学序列分析法(Sanger)。酶学测序法的基本原理优点是：()(a)碱基与特殊染料间不同的相互作用(b) 一个合成引物的延伸和DNA修复合成的可靠终止(c)限制性位点与DNA末端标记的相关性(d)可同时对DNA双螺旋的两条链进行测序(e)反应是DNA特异的，RNA不会带来干扰。这样既减少纯化步骤，也节约了开支。35关于cDNA 的最正确的说法是：()(a)同mRNA互补的单链DNA (b)同mRNA互补的双链DNA(c)以m

23、RNA为模板合成的双链 DNA(d)以上都正确36 用碱法分离质粒DNA 时， 染色体 DNA 之所以可以被除去，是因为：()(a)染色体DNA断成了碎片(b)染色体DNA分子量大，而不能释放(c)染色体变性后来不及复性(d)染色体未同蛋白质分开而沉淀37 关 于 碱 解 法 分 离 质 粒 DNA ， 下 面 哪 一 种 说 法 不 正确 ?()(a)溶液I的作用是悬浮菌体(b)溶液II的作用是使DNA 变性(c)溶液田的作用是使 DNA复性(d)质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性38 Clark 做了一个有趣的实验，发现 TaqDNA 聚合酶可以不需要模板，在双链DNA

24、的末端加一个碱基，主要是加() (a)dGTP (b)dATP(c)dCTP (d)dTTP39 根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在下列文库中，()属 cDNA 文库(a) YAC 文库(b) MAC 文库(c) 扣减文库(d) BAC 文库40 下面关于多克隆位点(multiple clone site,MCS) 的描述，不正确的句是()(a)仅位于质粒载体中(b)具有多种酶的识别序列(c)不同酶的识别序列可以有重叠(d) 一般是人工合成后添加到载体中41在 cDNA 技术中，所形成的发夹环可用()(a)限制性内切核酸酶切除(b)用31外切核酸酶切除(c)用S1核

25、酸酶切除(d)用51外切核酸酶切除42在DNA 的酶切反应系统中，通常：()用SSC缓冲液 (b)加入Mg2+作辅助因子(c)加入BSA等保护剂(d)上述说法中，有两项是正确的43 黏性末端连接法，不仅操作方便，而且()(a)产生新切点(b)易于回收外源片段(c)载体不易环化(d)影响外源基因的表达44在下列表型中，()是基因工程上理想的受体菌表型(a)r+m+rec*(b)r-m-rec-(C)r-m-rec+(d)r+m+rec45关于 DNA 接头在基因工程中的作用，下列说法中哪一项不正确?()(a)给外源DNA添加适当的切点(b)人工构建载体(d)增加调控元件)(b)所有蛋白质的结构基

26、(c)调整外源基因的可读框46 cDNA 文库包括该种生物的(a)莫些蛋白质的结构基因因所有结构基因(d)内含子和调控区47下列关于建立cDNA 文库的叙述中，哪一项是错误的 ?()(a)从特定组织或细胞中提取DNA或RNA(b)用反转录酶合成 mRNA的对应单链DNA(c)以新合成的单链 DNA为模板合成双链 DNA(d)新合成的双链DNA甲基化48下列对黏性末端连接法的评价中，哪一项是不正确的()(a)操作方便(b)易于回收片段(c)易于定向重组(d)载体易于自身环化，降低重组率49关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确 ?()(功具有可诱导性(b)具有可转移性(c)细菌生长的任何

27、时期都可以由现(d)不同细菌由现感受态的比例是不同的50下面关于用T4 多核苷酸激酶标记5' 端制备探针的描述中 ()是不正确的。(a)既能标记DNA ,又能标记RNA(b)既能标记双链 DNA 又能标记单链DNA(c)只能标记突生的5'端不能标记其他类型末端(d)DNA 或 RNA 必须有 5'-OH 的存在51 Southem 印迹的 DNA 探针 ()杂交。(a)只与完全相同的片段(b)可与任何含有相同序列的 DNA 片段(c)可与任何含有互补序列的DNA片段.(d)可与用莫些限制性内切核酸酶切成的DNA片段(e)以上都是52 用下列方法进行重组体的筛选，只有()

28、说明外源基因进行了表达。(a)Southem 印迹杂交(b)Northem 印迹杂交(c)Western印迹(d)原位菌落杂交53下列哪一个不是Southern 印迹法的步骤?()(a)用限制酶消化 DNA (a)DNA与载体的连接(c)用凝胶电泳分离 DNA片段 (d)DNA片段转 移至硝酸纤维素膜上(e)用一个标记的探针与膜杂交54 报告基因()(a)以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列(b)以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区(c)能用于检测启动子的活性(d)能用于确定启动子何时何处有活性55 在利用 lacZ 失活的显色反应筛选法中，IPTG 的作用是()(a)诱导

29、宿主的a肽的合成 (b)诱导宿主的3肽的合成(c)作为酶的作用底物(d)作为显色反应的指示剂56 切口移位是指在()作用下，使()带上放射性标记。(a)DNA 聚合酶I， RNA (b)DNA 聚合酶 I， DNA(c)DNA 聚合酶田，RNA (d)DNA 聚合酶田，DNA57用于核酸分子杂交的探针可以是放射性标记的()(a)DNA (b)RNA 抗体 (d)抗原58 Southern 印迹是用DNA 探针检测DNA 片段， 而 Northern印迹则是：()(b)用RNA探针(d)用DNA探针)(b)根据载体基因(d)根据DNA同(a)用RNA探针检测DNA片段检测 RNA 片段(c)用D

30、NA探针检测RNA片段检测蛋白质片段59用免疫化学法筛选重组体的原理是(a)根据外源基因的表达的表达(c)根据 mRNA 同DNA 的杂交 DNA 的杂交60随机引物标记探针，下列各项中哪一项是不正确?()(a)双链 DNA、单链 DNA、RNA 都是可以标记的(b)不需要用Dnase I预处理(c)反应时可用 Klenow酶1(d)反应时可用 DNA38 / 3161 在切口移位标记DNA 探针时只能使用()(a)Klenow 酶(b)DNA 聚合酶 I (c)DNA聚合酶n (d)DNA 聚合酶m62要对一双链的DNA 分子进行31末端标记，可用()(a)Klenow 酶(b)DNA 聚

31、合 酶 I(c)T4DNA 聚合酶(d)T7DNA 聚合酶答案1 c； 2c；3 b；4b5b， C， d， e；6c； 7b；8d；9 d；10B；11d；12 a；13d；14b 15d；16c； 17a，b；18 a；19c；20 d；21c； 22C；23 b；24C； 25d；26 a，C， d； 27b； 28 c；29 b；30 a；31 c；32a,c,d,e，33 a，b， c； 34 b；35 c； 36c；37 d；38b；39c；40a；41c；42 a，b，c；43b；44 b；45d；46 a； 47a；48c；49c；50b；51 c；52c；53 b；54a,c

32、,d；55a；56 b； 57 a，b；58c；59a；60d；61b；62c； 三、简答题1 说明 Sanger DNA 测序法的原理。Sanger DNA 测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5'端向3'端聚合(DNA 聚合酶参与了细菌修复DNA 合成过程)； (2)可延伸的引物必须能提供游离的3'羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3'羟基末端得序4 种双脱氧核苷酸终止反应，则会获4 组长度不同的DNA 片段。通过比较所有DNA 片段的长度可以得知核苷酸的歹U。2某学生在用EcoRI 切割外源DNA 片段时，出现了星号活

33、性，请分析可能的原因?盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。3 .在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp的H类限制性内切核酸酶的识别序列， 该位点的序列可能是什么?回文序列是：5'-CATATG-3，4 .下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是n类酶的识别序列：GAATCG ， AAATTT ， GATATC ， ACGGCA? 为什么 ?GATATC; AAATTT,因为它们是回文序列。5当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么 ?注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前

34、将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。6 为什么反转录酶在聚合反应中会出错?由于反转录酶缺少在E coli DNA 聚合酶中起校正作用的3'-5'外切核酸酶活性，所以聚合反应往往会出错，在高浓度的dNTP 和 Mg2+ 下，每 500 个碱基中可能有一个错配。7 什么是测序酶(sequenaseTM)?所谓测序酶即是修饰了的T7 DNA 聚合酶， 是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去 28 个氨基酸，这样使 T7 DNA 聚合酶完全失去了3'-5'的外切核酸酶活性，只有5'-3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了

35、39倍，测序时常用此酶。8 什么是 S1 核酸酶作图(S1 nuclease mapping)?S1 核酸酶作图是一种对RNA 转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法9 YAC 载体具有什么样的功能性DNA 序列?为什么在克隆大片段时，YAC 具有优越性?YAC 带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA 复制起点，两个端粒。 YAC 能够容纳长达几百kb 的外源 DNA ，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。10 列举质粒载体必须具备的4 个基本特性。(1)独立复制；(2)有

36、选择标记；(3)有独特的酶切位点；(4)能转化但不扩散。11 什么叫穿梭载体？含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA 片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以， 很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭 )。12 如何将野生型的噬菌体改造成为一个理想的载体?(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)；(2)削减酶切位点；(3)添加选择标记；(4)引入终止突变13 PCR 的基本原理是什么?用 PCR 扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息?(1)DNA 半保留复制的原理，在体外进行DNA 的变性、复性和引物延伸。(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA

37、序列。14 cDNA 克隆与基因组克隆有何不同?基因组克隆包含所有不在cDNA 中出现的内含子。15 怎样将一个平末端DNA 片段插入到EcoR I 限制位点中去?化学合成一些长为10bp 含有 EcoRI 识别位点的短的DNA 片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI 切割这种连接片段，就会产生EcoRI 的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI 的限制性内切酶位点中16 简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。(1)COS 位点可以自身环化；(2)可以利用COS 位点包装噬菌体颗粒；(3)可以感染寄主细胞；(4)利用质粒复制子复制，不整合、不裂解。17 酵母人工染色体要在酵母

38、细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构?(1)着丝粒；(2)端粒；(3)ARS 序列。18 何谓 YAC? 主要特性是什么?(1)含有来自其他生物DNA 的酵母人工染色体，叫YAC；(2)主要特性是可以克隆较大的外源片段。19 Muller 的 PCR 反应同大肠杆菌体内的DNA 复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里 ?PCR 用双引物，体内复制用单引物。20欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如 E coli) 中进行表达，克隆时应注意哪些问题?应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌。21假定你分离到一个E coli 的 Thy- 突变体，并推测有可能是ThyA 基因突变。请设

39、计一个方案用PCR 从染色体DNA 扩增突变的ThyA 基因， 测定突变的序列。(注：E coli野生型的ThyA 基因的序列是已知的)为了扩增突变体的thyA 基因， 先设计一对引物，其中一个引物的序列与thyA 基因的5端相同，另一个引物同该基因的3'端互补。在引物的 5'端加上合适H类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染色体DNA 同引物混合后，进行PCR 扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到合适的载体再测序。22 你在做 Southern 印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤是用 NaOH 溶液浸泡凝胶，使

40、DNA 变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步，直接将 DNA 从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自显影片是空白。错在哪里?如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。23切口移位(nick translation) 标记探针的主要步骤有哪些?(1)DNaseI 造成切口；(2)DNA 聚合酶 III 的 53外切核酸酶进行切割；(3)DNA聚合酶出的5' 3'合成酶进行修补；(4)在修补过程中，随着切口 (nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中。24.用EcoRI和Hindm分别切割同一

41、来源的染色体DNA ,并进行克隆，在前者的克隆中筛选到A 基因，但在后者的克隆中未筛选到A 基因，请说明原因。原因是：Hind出的切点在A基因内。25什么是Western 印迹?它与Southern 印迹有什么不同?Western 印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与 Southern 的不同在于探针的性质不同，在 Western 印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。26.用一限制性内切核酸酶切割Lac+ Tet+的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位

42、点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用DNA 聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac- Tets受体菌，筛选Tetr 转化子，问：Lac 的基因型是什么?并说明原因。基因型是lac-.原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以 Lac的基 因是缺陷的。27在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA? 为什么要在cDNA 前加上细菌的启动子?这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。四、问答题：1 说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。2 什么是限制性内切核酸酶的星号

43、活性? 受哪些因素影向?3 影响 DNA 连接酶催化连接反应的因素有哪些?4 什么是 Klenow 酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?5细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?6 .入外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么 ？在基因工程中有什么应用?7 Mn2+ 、 Mg2+ 对 Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影响 ?Dnase I 在基因工程中有什么作用?8质粒如何维持在细胞中的稳定？9由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行严格的监控，质粒载体的安全性是十分

44、重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面 ?10为什么野生型的噬菌体 DNA 不宜作为基因工程载体?11 什么是蓝白斑筛选法?12 蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?13 M13 系列载体具有哪些优缺点?14黏粒载体具有哪些特点与不足?15辅助噬菌体DNA 和相应的噬菌粒是如何协同工作的?16 如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因?17 什么是基因文库?18 什么是基因组文库(genomic library)? 构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?19 什么是 cDNA 文库 (complementDNAlibrar

45、y)? 同基因组文库有何差别?20 黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。21什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)? 用何种方法加尾?具有哪些优缺点 ?22何谓接头连接法(1inker ligation)?23什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高?24为了大量获得许多用于生化鉴定的产物，你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，你如何确保最终能得到产物?25 莫一质粒载体具有 Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因 内有一 Bgl I 的切点。现用Bgl I

46、切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?26 以 pBR322 DNA 作为载体，从四环素抗性基因区克隆外源 DNA 时，可采用环丝氨酸富集法筛选重组体，说明其基本原理和基本操作过程。27 放射性抗体检测法(radioactive antibody test) 的基本原理是什么 ?28 什么是随机引物(random primer)? 如何标记DNA?29什么是印迹(blotting) 杂交 ?30什么是原位菌落杂交(colony hybridization)?31说明Sou

47、thern 杂交的原理和方法。32 Northern 印迹与 Southern 印迹有什么不同?33建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆 ?答案：1 答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的各一个首字母，再加上序号。基本原则：3-4 个字母组成，方式是： 属名 +种名 +株名 +序号； 首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写；第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写；(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。顺

48、序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I 、n、出、 等，用正体。2 答：n类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5 , v v)； (2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U ugDNA) ； (3)低离子强度(<25 mmol L)； (4)高 pH

49、(8 0以上)；(5)含有有机溶剂，如 DMSO,乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+, Cu2+, C02+, Zn2+等)。3 答影响 DNA 连接酶催化连接反应的因素有很多，但温度对连接反应的影响较大。黏性末端链通常以12° C 一 15° C 最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在DNA 的退火问题，但是温度高于30，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高10-100 倍。 DNA 中有残存的tRNA不会抑制DNA

50、 连接酶的活性，但是， 如果 NaCl 的浓度高于150mmol L， 则对连接反应有强的抑制作用。另外反应体系中有NH4+ 离子的存在，对 E coli DNA 连接酶具有激活作用。E coli DNA连接酶需要NAD+ 作辅助因子，而T4 DNA 连接酶需要ATP。4 答Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I,得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa， 它具有 5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA 聚合酶 I 中会降解5'引物的5

51、'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。Klenow 酶主要有下列用途(1)修复反应，制备平末端可用 Klenow 酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或 3'突出末端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA 片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。用 Klenow 酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow 酶的 DNA 聚合酶活性，是填补反应；而修复3'突出末端则是用Klenow 酶的3'-5'外切核酸酶的

52、活性，是切割反应。用 Klenow 酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的，改用T4DNA 聚合酶或其他的酶是更好的选择。(2) 标记 DNA3' 突出末端(protruding end)该反应分两步进行先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，产生3'隐含末端，然后在高浓度的标记底物( -32p-dNTP) 存在下，使降解(3'-5')作用与聚合(5'-3')作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchange/replacement reaction)。不过这一反应用T4DNA 聚合酶的效果更好，

53、因它的3'-5'外切核酸酶活性较强。(3)其他的一些用途包括用双脱氧末端终止法进行DNA 序列分析、用于cDNA 第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension) 制备单链DNA探针等。5答主要差别是：CIP68° C时失活，而BAP68° C稳定，且耐酚抽提。应用：(1)dsDNA 的 5'端脱磷酸，防止DNA 的自身连接。但是用CIP 处理后，最好将CIP 除去后，再进行连接反应。(2)DNA 和 RNA 脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。6答外切核酸酶是从噬菌体感染的E coli 中分离纯化的，能够从双链DNA 上依次切下5'单核苷酸，作用底物是双链DNA 的 5'磷酸末端，不能切割羟基化5'端。该酶虽然能切割单链 DNA, 但效率较低(下降200 倍 )。不能切割带切口或缺口的dsDNA 。该酶作用时是行进性的，一步一步进行的。在基因工程中主要用于除去双链DNA 突出的5'末端，以便让末端转移酶加尾。7答DNase I是一