植物快繁的商业化应用

1、第九章 植物离体繁殖1、定义2、特点第一节 植物快繁的器官形成方式根据器官形成方式的不同，将植物器官的再生分为五种类型： 短枝发生型 丛生芽发生型 不定芽发生型 胚状体发生型 原球茎发生型一、短枝发生型是指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再生成苗的繁殖方法。特点：一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，移栽成活率高。二、丛生芽发生型是使外植体携带的顶芽或腋芽在适宜培养环境中不断发生腋芽而呈丛生状芽，将单个芽转入生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法。特点：是大多数植物快繁的主要方式，不经过愈伤组织，能使无性系后代保持原品种的特性，在生产中普遍使用

2、。三、不定芽发生型是外植体在适宜培养基和培养条件下，经过脱分化形成愈伤组织，然后经过再分化诱导愈伤组织产生不定芽，或外植体不形成愈伤组织而直接从其表面形成不定芽，将芽苗转移到生根培养基中，经培养获得完整植株的繁殖方法。有时将从愈伤组织途径再生不定芽的方式成为器官发生型，将外植体一直接再生不定芽的方式成为器官型。特点：是许多植物快繁的主要方式，增殖率高于丛生芽发生型，但是变异植株发生频率增高，会导致嵌合形状发生分离。四、胚状体发生型是外植体在适宜的培养环境中，经诱导产生体细胞胚的繁殖方法。外植体诱导产生的愈伤组织进一步发育成类似合子胚的体细胞胚，或外植体表皮细胞直接发育成体细胞胚。特点：成苗数量

3、大，速度快，结构完整，是外植体增殖系数最大的途径。但胚状体发生发育情况复杂，应用没有丛生芽和不定芽广泛。与丛生芽和不定芽再生的小植株相比，具有两个显著差异：1）胚状体多起源于单细胞。2）生理隔离。五、原球茎发生型是兰科植物的一种快繁方式，是茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎的繁殖类型。特点：原球茎是短缩的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的类似嫩茎的器官，它可以增殖，形成原球茎丛。由茎尖或腋芽外植体诱导产生原球茎，切割原球茎进行增殖，或停止切割使其继续培养而转绿，产生毛状假根，叶原基发育成幼叶，将其转移培养生根，形成完整植株。第二节 植物快繁的程序包括四个阶段： 无菌培养的建立、 繁殖体的增殖、 芽苗

4、的生根、 小植株的移栽驯化一、无菌培养的建立1、母株和外植体的选取母株应选择性状稳定、生长健壮、无病虫害的成年植株。木本植物、较大的草本植物多采用带芽茎段、顶芽或腋芽作为快繁的外植体。易繁殖、矮小或具短缩茎的草本植物多采用叶片、叶柄、花茎、花瓣等外植体。一、无菌培养的建立2、无菌培养物的获得选取的外植体经适当有效的灭菌处理后，接种在基本培养基中，以检测每个材料的菌类污染情况。一般每一个培养瓶中接种一块材料，避免相互污染。对接种15天以上仍未见污染并且成活的外植体，可转移至促使其启动生长的培养基中。一、无菌培养的建立3、外植体的启动生长不同外植体启动生长的方式不同，主要有：1）腋芽被刺激后进行生

5、长；2）茎段、叶片、花芽、子叶和其他器官外植体的伤口出产生不定芽；3）外植体切口表面产生愈伤组织。启动生长所用的培养基随植物种类、栽培方式和外植体类型的不同而异。生长素和细胞分裂素的浓度最重要，刺激腋芽生长时，细胞分裂素浓度为0.5-1.0mg/l，生长素水平很低；诱导不定芽形成时，需较高水平细胞分裂素；诱导愈伤组织时，增加生长素浓度并补充一定浓度的细胞分裂素。二、繁殖体增殖1、培养材料的增殖以上述五种方式进行增殖。每种植物采用哪种方式进行快繁，取决于培养目的和材料自身的可能性。二、繁殖体增殖2、增殖培养基增殖率是植株快速繁殖特别是商业性繁殖的重要指标。通常，基本培养基与阶段1相同，而细胞分裂

6、素和矿物元素的水平要高于阶段1，最佳浓度应通过实验确定进行。二、繁殖体增殖2、增殖体的大小和切割方法为了保证每次继代培养能获得同样的快速增殖效果，增殖茎段应具有最小组织量，即携带一个茎节，但从初代培养物中切割的茎段一般都有2-4个茎节。这些茎段可以垂直插入培养基中，深度不应淹没茎节；或水平放入培养基表面，以刺激侧芽萌动。初代培养物切割完茎段后，可以继续进行整块分割，再培养。三、芽苗生根1、离体生根所用基本培养基组成同阶段1，但需降低无机盐浓度，一般用1/2或1/4的量，并减少或除去细胞分裂素，增加生长素浓度。辅以黑暗培养，生根效果更好。三、芽苗生根2、活体生根又称试管外生根。芽苗可以先在生长素

7、中快速浸蘸或在含有相对高浓度生长素的培养基中培养5-10天，然后在温室中栽入培养基质中，辅以高湿度环境，几天后可自行生根。四、小植株的移栽驯化1、移栽洗去小植株根部附着的培养基，避免微生物繁殖污染，造成小苗死亡。将小植株栽入人工配制的混合培养基质中，基质用保湿又透气的材料，以利于小植株生长。四、小植株的移栽驯化2、驯化管理移栽的试管小植株和活体生根的小植株，湿度的控制十分重要。应采用加覆塑料薄膜、经常喷雾的方法。同时，逐步降低空气相对湿度，使其适应环境条件。移栽初期光照强度应减弱，经过一段时间适应后，在逐步增强。适宜温度与植物种类有关。防止菌类滋生，适当喷一些杀菌剂。第三节 影响植物快繁的因素

8、略讲第四节 植物快繁的商业化应用 目前能进行商业化生产的植物种类十分有限，大多数试管苗还停留在实验阶段，原因：生产成本高；缺乏生产经验；市场制约；试管苗生产性能不稳定。 一、商品化生产规模及工艺流程一、商品化生产规模及工艺流程（一）试管苗生产规模的确定（一）试管苗生产规模的确定 商业化生产规模的确定应以市场需求为标准，商业化生产规模的确定应以市场需求为标准，否则试管苗难以销售，造成经济损失。否则试管苗难以销售，造成经济损失。 外植体的入瓶；器官形成及增殖；试管小植外植体的入瓶；器官形成及增殖；试管小植株出瓶等试管苗生产过程均是在无菌条件下进行株出瓶等试管苗生产过程均是在无菌条件下进行的，因此，

9、试管苗生产规模是以无菌工作台的数的，因此，试管苗生产规模是以无菌工作台的数量来衡量的。量来衡量的。 一般一个单人无菌工作台可年生产一般一个单人无菌工作台可年生产10万万15万株苗，万株苗，一个一个1.2m0.6m2.0m的的6层培养架可年繁殖层培养架可年繁殖1.5万万2万株试管苗。年产万株试管苗。年产100万株的组培苗生产工厂，需万株的组培苗生产工厂，需810个个无菌工作台，培养架无菌工作台，培养架4050个。接种室面积应为个。接种室面积应为4050m2，培养室面积则为，培养室面积则为100120m2。 培养容器的数量取决于生产规模，一个培养容器的数量取决于生产规模，一个6层培养架层培养架(1

10、2mX06mX2Om)可放置可放置900个左右三角瓶，还需个左右三角瓶，还需增加增加1015的周转用培养容器。的周转用培养容器。(二二)商业化实验室的设计商业化实验室的设计 根据生产规模和组织培养的生产程序，实验室应尽量根据生产规模和组织培养的生产程序，实验室应尽量布局合理，使生产程序能连续、有效地进行。布局合理，使生产程序能连续、有效地进行。 (三三)商业化生产的配套设施商业化生产的配套设施 配套设施包括过渡培养室和露地配套设施包括过渡培养室和露地 过渡培养室可内装喷灌设施和可移动苗床。每平方米过渡培养室可内装喷灌设施和可移动苗床。每平方米苗床可栽种苗床可栽种800株试管苗，一茬苗的过渡周期

11、为株试管苗，一茬苗的过渡周期为30d，年，年产产100万株苗的过渡培养室，建造面积应为万株苗的过渡培养室，建造面积应为400600m2。(四四)商业化生产的工艺流程商业化生产的工艺流程（五）试管苗增殖率的估算（五）试管苗增殖率的估算 Y=mX nY-年繁殖数年繁殖数 m-无菌母株苗数无菌母株苗数 X-每个培养周期增殖倍每个培养周期增殖倍数数 n-全年可增殖的周期数全年可增殖的周期数 (六六)生产计划的制定和实施生产计划的制定和实施 1生产计划的制定生产计划的制定 销售计划销售计划=实际生产数量实际生产数量X1损耗损耗(510)移栽成活率移栽成活率2生产计划的实施生产计划的实施准备繁殖材料。准备

12、繁殖材料。 合格繁殖材料的快速增殖。合格繁殖材料的快速增殖。 存瓶增殖总瓶数存瓶增殖总瓶数=月计划生产苗数月计划生产苗数/每个增殖瓶月可每个增殖瓶月可产苗数产苗数 月计划生产苗数月计划生产苗数=每个操作人员每天可接苗数每个操作人员每天可接苗数月月工作日工作日人员数人员数全年生产量全年生产量=全年初评苗数全年初评苗数炼苗成活率炼苗成活率二、商业化生产效益分析二、商业化生产效益分析（一）规模分析实例（一）规模分析实例 假定平均每天取用假定平均每天取用30瓶母种，转接成瓶母种，转接成100瓶，其中瓶，其中30瓶为增殖用，以维持母株的瓶数，另外瓶为增殖用，以维持母株的瓶数，另外70瓶用于生根。瓶用于生

13、根。在在3542天内有天内有3036个工作日。个工作日。 存架增殖总瓶数存架增殖总瓶数T=3030或或3036 即：即：T=900或或1080（瓶）（瓶） 理论值与实际值的关系：理论值与实际值的关系： 一株试管苗繁殖数实际值比理论值低得多。一株试管苗繁殖数实际值比理论值低得多。三、成本核算与效益分析三、成本核算与效益分析（一）成本核算一）成本核算1、成本核算目的、成本核算目的通过成本核算可了解：通过成本核算可了解：生产过程中的各种消耗；生产过程中的各种消耗；管理工作的质量；管理工作的质量；各项技术措施的效果；各项技术措施的效果；产品价格的制定标准。产品价格的制定标准。2、试管苗商业化的生产成本

14、人工费用。管理人员、技术人员、操作人员的工资和奖金；生产物资费用。培养基配制所需的各种药品、低值易耗品、当年消耗品等。设备折旧费用。试管苗生产所用的各种固定资产的折旧费。水电费用。商业化生产环节中消耗的水电费。其他费用。办公费、培训费、差旅费、种苗费、宣传费等。(二二)产品质量监控产品质量监控 商业化生产的试管植株需进行产品质量的跟商业化生产的试管植株需进行产品质量的跟踪监控，如接种状况、污染率、生长情况、生根踪监控，如接种状况、污染率、生长情况、生根苗数量、出瓶苗质量等，并建立试管苗出瓶标准。苗数量、出瓶苗质量等，并建立试管苗出瓶标准。根据出瓶苗的质量等级、移栽的气候条件，估算根据出瓶苗的质

15、量等级、移栽的气候条件，估算移栽成活率。并以估算结果为依据，控制和调整移栽成活率。并以估算结果为依据，控制和调整生产节奏及进度。生产节奏及进度。（三）降低商业化生产成本的措施（三）降低商业化生产成本的措施1、提高劳动生产率、提高劳动生产率 2、减少设备投资，延长使用寿命、减少设备投资，延长使用寿命 3、降低消耗、降低消耗 4、降低污染，提高鳖殖率和成活率、降低污染，提高鳖殖率和成活率 5、简化培养基、简化培养基 6、减少污染、褐变和玻璃化现象、减少污染、褐变和玻璃化现象 7、发展多种经营，开展横向联合、发展多种经营，开展横向联合 8、商品化生产的经营管理、商品化生产的经营管理四、培养中常见问题

16、四、培养中常见问题（一）（一）污染污染的原因及其预防措施的原因及其预防措施1 1、污染原因、污染原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。杂菌，导致培养失败的现象。 病原菌：细菌及真菌两大类。病原菌：细菌及真菌两大类。细菌污染特点细菌污染特点- -菌斑呈黏液状，接种后菌斑呈黏液状，接种后1-21-2天发现。天发现。污染途径：污染途径： 外植体带菌外植体带菌 培养基及器皿灭菌不彻底培养基及器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程操作人员未遵守操作规程 真菌污染的特点真菌污染的特点- -污染部分长有不同颜色的霉菌，污染部分

17、长有不同颜色的霉菌，接种后接种后3-103-10天发现。天发现。 污染途径：污染途径： 周围环境不清洁周围环境不清洁 超净工作台过滤装置失效超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大培养瓶的口径过大2 2、污染的预防措施、污染的预防措施防止材料带菌的措施防止材料带菌的措施- -茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养。无糖营茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养。无糖营养液或自来水使枝条抽枝，以新抽嫩枝作外植体。养液或自来水使枝条抽枝，以新抽嫩枝作外植体。- -晴天取材，下午取材，经日晒过可杀死部分细菌或真菌。晴天取材，下午取材，经日晒过可杀死部分细菌或真菌。- -接种时除去外部韧皮组织，

18、只接内部的分生组织。接种时除去外部韧皮组织，只接内部的分生组织。 （2 2）外植体的灭菌）外植体的灭菌 - -多次灭菌法，次氯酸钠多次灭菌法，次氯酸钠- -无菌水无菌水- -次氯酸钠次氯酸钠- -多种药液交替浸泡法，肥皂水多种药液交替浸泡法，肥皂水- -酒精酒精- -次氯酸钠次氯酸钠- -无菌水。无菌水。器皿与金属器械的灭菌器皿与金属器械的灭菌 玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热灭菌玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热灭菌 金属器皿一般火焰灭菌，也可干热灭菌金属器皿一般火焰灭菌，也可干热灭菌布质制品的灭菌布质制品的灭菌 湿热灭菌湿热灭菌无菌操作室的灭菌无菌操作室的灭菌 2%2%新捷尔灭或新捷尔灭或70%70

19、%酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。期甲醛和高锰酸钾熏蒸。严格按照操作程序。严格按照操作程序。（二）外植体的（二）外植体的褐变褐变及其防止措施。及其防止措施。1 1、褐变的原因、褐变的原因 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。它酶的活性，影响

20、外植体的分化，最后变褐死亡的现象。 基因型基因型 某些植物酚类物质含量较多。某些植物酚类物质含量较多。外植体的生理状态外植体的生理状态 幼年的材料培养含醌类物质较少。幼年的材料培养含醌类物质较少。培养基的成分培养基的成分- -过高的无机盐浓度过高的无机盐浓度- -生长调节物质使用不当，生长调节物质使用不当，BABA过多过多- -分生能力强的材料，氧化受抑制，褐变也被抑制分生能力强的材料，氧化受抑制，褐变也被抑制- -培养条件不适宜，温度过高或光照过强，褐变加速。培养条件不适宜，温度过高或光照过强，褐变加速。材料转移时间材料转移时间 时间过长引起材料褐变。时间过长引起材料褐变。2 2、褐变的防止

21、措施、褐变的防止措施选择适宜的外植体及最佳培养基。选择适宜的外植体及最佳培养基。连续转移。连续转移。加抗氧化物。加抗氧化物。加活性炭。加活性炭。0.1-0.5%0.1-0.5%活性炭活性炭 （三）（三）玻璃化玻璃化现象及其预防措施现象及其预防措施1 1、玻璃化现象及其产生原因、玻璃化现象及其产生原因玻璃化是在细胞生长过程中的环境产生变化，试管苗玻璃化是在细胞生长过程中的环境产生变化，试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。主要原因是：为了适应变化了的环境而呈玻璃状。主要原因是：激素浓度激素浓度 BABA浓度提高，导致玻璃化苗的产生。浓度提高，导致玻璃化苗的产生。琼脂浓度琼脂浓度 琼脂浓度低，玻璃化苗增加。琼脂浓度低，玻璃化苗增加。温度温度 低温易形成玻