多克隆抗体的制备及抗体效价测定ppt课件

1、多克隆抗体的制备及抗体效价测定 目的要求目的要求 掌握多克隆抗体制备的根本原理。掌握多克隆抗体制备的根本原理。 掌握多克隆抗体制备的操作步骤。掌握多克隆抗体制备的操作步骤。 掌握肥达反响的实验原理、操作流程和结果判掌握肥达反响的实验原理、操作流程和结果判别。别。 熟习熟习ELISA的实验原理、操作流程和结果判别。的实验原理、操作流程和结果判别。 了解细菌抗原和病毒抗原免疫程序上的异同。了解细菌抗原和病毒抗原免疫程序上的异同。 了解免疫动物的选择原那么。了解免疫动物的选择原那么。原理1、克隆、克隆(clone)： 是指无性繁衍细胞系，是由单一是指无性繁衍细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁衍而构成的

2、一簇细胞纯系。在个祖先细胞分裂繁衍而构成的一簇细胞纯系。在这个家族的一切成员中，如无突变发生，其基因这个家族的一切成员中，如无突变发生，其基因是完全一样的。是完全一样的。2、多克隆抗体、多克隆抗体polyclonal antibody, pAb：用：用一种包含多种抗原决议簇的抗原免疫动物，可刺一种包含多种抗原决议簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实践上是含有多种不同抗体。所获得的免疫血清实践上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。抗体的混合物，即多克隆抗体。 3、单克隆抗体、单克隆抗体monoclo

3、nal antibodies, mAb：由一个识别一种抗原表位的：由一个识别一种抗原表位的B细细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反响性。性强、效价高、少或无交叉反响性。 抗体的制备技术阅历了三代：第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体polyclonal antibody；第二代抗体是经过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决议簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)；第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(genetic engineering

4、 antibody)。Ab1Ab3Ab4单克隆抗体单克隆抗体抗原抗原Ab1抗血清抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清多克隆抗体普通抗血清多克隆抗体脾脾B细细胞胞骨髓瘤小鼠骨髓瘤小鼠取腹水取腹水骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HAT培育，培育，稀释稀释单单克克隆隆抗抗体体和和多多克克隆隆抗抗体体产产生生区区别别表表示示图图杂交瘤细胞杂交瘤细胞+ PEG, 交融交融Ab2 多克隆抗体制备流程多克隆抗体制备流程 一免疫原的制备一免疫原的制备 二免疫动物二免疫动物 三免疫血清的搜集三免疫血清的搜集 四免疫血清的鉴定四免疫血清的鉴定 五免疫血清的保管五免疫血清的保管操作步骤操作步骤一、免疫原的

5、制备一、免疫原的制备免疫原免疫原immunogen指能刺激机体免疫系指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性最重要的性质是免疫原性immunogenicity免疫原免疫原天然抗原、人工天然抗原、人工 合成抗原；合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原； 一细胞性抗原制备：一细胞性抗原制备： 绵羊红细胞绵羊红细胞SRBC- 溶血素；溶血素； 细菌细菌- 抗菌抗体动物免疫血清抗菌抗体动物免疫血清二可溶性抗原制备：二可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。指蛋白质、多糖和脂类等。1细胞的破碎物理法

6、、化学法细胞的破碎物理法、化学法 反复冻融法反复冻融法 超声破碎法超声破碎法 自溶法自溶法 酶处里法酶处里法 外表活性剂处置法外表活性剂处置法 2提取与纯化：提取与纯化： 超速离心分别超速离心分别是一种根据分别物质是一种根据分别物质的比重特点，经过差速或梯度密度离心，的比重特点，经过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分别。只适宜少数大分子物质的分别。选择性沉淀选择性沉淀选择某抗原理化特性，采用相应沉选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境。淀剂或溶液环境。 核酸去除核酸去除 盐析沉淀法盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法

7、有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法高分子聚合物沉淀法例：例： 50% 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋；饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋； 8% 8%12%PEG600012%PEG6000可沉淀可沉淀IgGIgG。 盐析法沉淀抗原的机理盐析法沉淀抗原的机理 超滤法超滤法利用孔径大小不同的特制薄膜对利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进展滤筛。不同分子大小的抗原物质进展滤筛。层析法层析法 凝胶过滤凝胶过滤 离子交换离子交换 亲和层析亲和层析电泳电泳略略 凝胶过滤层析凝胶过滤层析( 分子筛分子筛)的作用机理的作用机理 亲和层析的作用机理亲和层析的作用机理3鉴定：鉴定： 鉴

8、定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。纯度以及免疫学活性。蛋白的含量蛋白的含量定氮紫外光定氮紫外光280nm等等分子的质量分子的质量电泳、质谱电泳、质谱蛋白的纯度蛋白的纯度电泳等电泳等免疫学活性免疫学活性免疫双分散、免疫印迹免疫双分散、免疫印迹 抗原性质分析结果三半抗原性免疫原的制备三半抗原性免疫原的制备1.载体选择载体选择常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。聚合物。1蛋白质类：常用的有人血洁白蛋白、蛋白质类：常用的有人血洁白蛋白、牛血洁白蛋白、血蛋白等，其中以牛血牛血洁白蛋白、血蛋白等，其中以牛

9、血洁白蛋白最为常用。洁白蛋白最为常用。2多肽类聚合物：是由人工合成的多多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良好的载体，常用肽聚合物，也是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。的有多聚赖氨酸。3大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮PVP、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素(CMC)等皆可等皆可与半抗原结合，参与福氏完全佐剂可诱与半抗原结合，参与福氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。导动物产生良好的抗体。2.衔接方法衔接方法 半抗原与载体的衔接有物理法和化半抗原与载体的衔接有物理法和化学法。学法。物理法物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原是用物理吸附法将载体与半抗原衔接，其原

10、理是经过电荷和微孔来吸半衔接，其原理是经过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有抗原，吸附载体主要有PVP和和CMC等；等；化学法化学法 是利用某些功能基团把半抗原衔是利用某些功能基团把半抗原衔接到白质类或多肽类聚合物载体上。不接到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进展衔接。同的半抗原应选用不同的方法进展衔接。 根据半抗原拥有的化学基团不同，衔接方法主要有以下几类：带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基构成稳定的肽键，带氨基的半抗原那么可与载体羧基缩合。带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体衔接，需求用化学方法如琥珀酸酐法、

11、O-羧甲基羟胺法等方法将之转变为带有羧基的半抗原衍生物后才干与载体衔接。带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原衍生物。四免疫佐剂四免疫佐剂某些物质与抗原一同或先于抗原注某些物质与抗原一同或先于抗原注入机体，可加强机体对该抗原的入机体，可加强机体对该抗原的特异性免疫应对或改动免疫应对特异性免疫应对或改动免疫应对类型，此类物质称为免疫佐剂类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。，简称佐剂。 佐剂的种类佐剂的种类 佐剂普通包括以下几类：佐剂普通包括以下几类： 无机佐剂：无机佐剂： 如氢氧化铝、明钒等如氢氧化铝、明钒等 生物性佐剂

12、：生物性佐剂： 如结核分枝杆菌、卡介苗、如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；细胞因子等； 人工合成佐剂：人工合成佐剂： 如双链多聚肌苷酸：胞苷如双链多聚肌苷酸：胞苷酸酸poly I：C、双链多聚腺苷酸：尿苷酸、双链多聚腺苷酸：尿苷酸poly A：U； 油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等； 纳米佐剂纳米佐剂 弗氏佐剂Freunds adjuvant,分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂矿物油或花生油和

13、乳化剂羊毛脂或吐温-80按1：11：5比例混合而成； 后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水乳化液。 佐剂与抗原混合乳化的方法：研磨法搅拌混合法 2. 佐剂的免疫生物学作用佐剂的免疫生物学作用加强抗原免疫原性：使无或微弱免疫加强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物量变成耐久或强的免疫原；原性的物量变成耐久或强的免疫原；加强机体对抗原刺激的反响性，提高加强机体对抗原刺激的反响性，提高初次应对和再次应对所产生的抗体滴度；初次应对和再次应对所产生的抗体滴度；改动抗体类型，使产生抗体由改动抗体类型，使产生抗体由IgMG型型转变为转变为IgG型；型；引起

14、或加强迟发性超敏反响。引起或加强迟发性超敏反响。3. 佐剂的作用机制佐剂的作用机制 佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：可加强抗原的外表积和改动抗原活性基团构可加强抗原的外表积和改动抗原活性基团构型，从而加强抗原的免疫原性。型，从而加强抗原的免疫原性。佐剂与抗原混合一同注入机体，可改动抗原佐剂与抗原混合一同注入机体，可改动抗原的物理性状，构成抗原储存库，延伸抗原在的物理性状，构成抗原储存库，延伸抗原在部分组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释部分组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。放。加强吞噬细胞的吞噬作用被佐剂吸附的抗加强吞噬细胞的吞噬作用被佐剂吸附的抗

15、原易被吞噬细胞吞噬，促进对抗原的处置，原易被吞噬细胞吞噬，促进对抗原的处置，刺激淋巴细胞增生，从而加强和扩展免疫应刺激淋巴细胞增生，从而加强和扩展免疫应对的效应。对的效应。 二、动物免疫一免疫动物的选择一免疫动物的选择 选择动物时应思索以下要素：选择动物时应思索以下要素：抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差别越远，其免疫源性越与免疫动物种属差别越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。越近，免疫效果越差。动物个体的选择。适龄、安康、体重符合动物个体的选择。适龄、安康、体重符合

16、要求的正常动物以雄性为佳；抗体需要求的正常动物以雄性为佳；抗体需求量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；求量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需求量大时，可选用绵羊、山羊、马、抗体需求量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。驴等大动物。抗原性质与动物种类抗原性质与动物种类二免疫方法二免疫方法 选定动物后，在免疫过程中应思选定动物后，在免疫过程中应思索免疫剂量、免疫途径、免疫次数、索免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间隔等要素。免疫间隔等要素。 (1) 免疫原的剂量：免疫原的接种剂免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体形量按免疫原性的强弱、动物的个体形状和免疫时间来确定。

17、初次免疫时，状和免疫时间来确定。初次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻木。剂量不宜过大，以免产生免疫麻木。 (2) 免疫途径与免疫间隔时间免疫途径与免疫间隔时间免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的珍贵抗原可采用淋视不同的免疫方案而异。对于不易获取的珍贵抗原可采用淋巴结免疫法。巴结免疫法。 免疫间隔时间是影响抗体产生的重要要素，其中初次与第二次免疫间隔时间是影响抗体产生的重要要素，其中初次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，普通以免疫的间隔时间尤为重要，普通以1020天为佳，二次后间天为佳，

18、二次后间隔时间普通为隔时间普通为710天，假设间隔时间太长，那么刺激减弱，天，假设间隔时间太长，那么刺激减弱，抗体效价不高。抗体效价不高。 常规制备痢疾致贺菌、伤寒杆菌抗血清的免疫方案 日期（天）16/711/1416/2121/2726/34途径皮内静脉静脉静脉静脉静脉抗原热杀死菌热杀死菌活菌活菌活菌活菌剂量（mL）1.00.50.20.51.02.0常规制备NDV、VSV抗血清的免疫方案日期（天）16/711/1416/2121/2726/34途径皮内静脉静脉静脉静脉静脉抗原弗氏完全佐剂 单纯抗原单纯抗原单纯抗原单纯抗原单纯抗原剂量（mL）1.00.50.20.51.02.0三、动物采血三

19、、动物采血采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，假设效价到达要求，应在末次免疫后一周假设效价到达要求，应在末次免疫后一周及时采血，否那么抗体效价会下降。及时采血，否那么抗体效价会下降。 (1) 颈动脉采血法颈动脉采血法 (2)心脏采血法心脏采血法 (3)静脉采血法静脉采血法 颈动脉分别图颈动脉分别图 四、免疫血清的鉴定四、免疫血清的鉴定 1. 效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集实效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集实验，可溶性抗原常用双向免疫分散实验、验，可溶性抗原常用双向免疫分散实验、ELISA等方法。等方法。 玻片凝集实验 肥达实验微量法：(Widals

20、 test ) ELISA 肥达实验肥达实验Widal test是用知的伤寒杆是用知的伤寒杆菌菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原与病抗原与病人血清做定量凝集实验，以测定患者血清中有无人血清做定量凝集实验，以测定患者血清中有无相应抗体，根据抗体含量的多少以及增长情况，相应抗体，根据抗体含量的多少以及增长情况，可协助诊断伤寒及副伤寒。可协助诊断伤寒及副伤寒。 【原理】【原理】 1抗原：伤寒杆菌抗原：伤寒杆菌“O、“H及甲、乙型副及甲、乙型副伤寒菌液。伤寒菌液。 2待检血清须经待检血清须经5630min灭活。灭活。 3生理盐水、生理盐水、24孔细胞反响板、中号试管、孔细胞

21、反响板、中号试管、吸管、水浴箱等。吸管、水浴箱等。【资料】【资料】 1取小号试管取小号试管1支，加生理盐水支，加生理盐水3.8ml，用吸，用吸管汲取患者血清管汲取患者血清0.2ml参与其中混匀，即为参与其中混匀，即为1：20稀稀释血清，总量为释血清，总量为4ml。 2取取1块块24孔细胞培育板，每排第孔细胞培育板，每排第1孔分别标孔分别标上上“O、“H、“PA、“PB符号。符号。 3. 第第1排第排第2孔至第孔至第5孔各加孔各加0.4 mL生理盐水。生理盐水。每排第每排第6孔为对照孔，各加生理盐水孔为对照孔，各加生理盐水0.1mL。 【操作步骤】【操作步骤】 4. 第第1排第排第2孔至第孔至第

22、5孔各加孔各加0.4 mL生理盐水。每生理盐水。每排第排第6孔为对照孔，各加生理盐水孔为对照孔，各加生理盐水0.1mL。 5. 每排第每排第1孔各加孔各加1：20的血清的血清0.1 mL。 6. 第第1排的第排的第2孔加孔加1：20的血清的血清0.4 mL，从第，从第2孔开场按倍比稀释法稀释血清，即第孔开场按倍比稀释法稀释血清，即第2孔吹吸混匀后孔吹吸混匀后取取0.4 mL至第至第3孔，再从第孔，再从第2孔依次取孔依次取0.1mL至第至第2、3、4排的第排的第2孔，第孔，第3孔混匀后取孔混匀后取0.4以此类推直至第以此类推直至第5孔孔，从第孔孔，从第5孔弃去孔弃去0.4mL。 这样各排第这样各

23、排第1孔至第孔至第5孔的血清稀释度为孔的血清稀释度为1：20、1：40、1：80、1：160、1：320。 6. 按按H、O、PA、PB标志符号，第标志符号，第1排排1-5孔孔参与参与“O型伤寒杆菌实验菌液，第型伤寒杆菌实验菌液，第2排各孔参与排各孔参与“H型伤寒杆菌实验菌液，第型伤寒杆菌实验菌液，第3排参与甲型副伤排参与甲型副伤寒杆菌实验菌液，第寒杆菌实验菌液，第4排参与乙型副伤寒杆菌实验排参与乙型副伤寒杆菌实验菌液，每孔均参与实验菌液菌液，每孔均参与实验菌液0.1mL。 7. 悄然振摇反响板，使其混匀，置悄然振摇反响板，使其混匀，置37恒温恒温箱箱23小时察看结果。小时察看结果。 肥达反响

24、稀释法表示表肥达反响稀释法表示表试验管（每管试验管（每管0.2ml） 对照管对照管 123456血清稀释度血清稀释度1:20 1:401:801:1601:320（NS 0.5ml） 1“O”抗原抗原 0.20.20.20.20.20.22“H”抗原抗原0.20.20.20.20.20.23PA抗原抗原0.20.20.20.20.20.24PB抗原抗原0.20.20.20.20.20.2血清最终稀释度血清最终稀释度 1:40 1:80 1:160 1:3201:640-【结果】【结果】 各孔凝集程度的判别以肉眼可见：孔内上清液完各孔凝集程度的判别以肉眼可见：孔内上清液完全清亮，细菌全部构成凝块

25、记为全清亮，细菌全部构成凝块记为“+ + + +；孔内；孔内上清液透明度达上清液透明度达75%，大部分细菌构成明显可见的，大部分细菌构成明显可见的凝集块为凝集块为“+ + +；孔内上清液透明度达；孔内上清液透明度达50%，约，约50%细菌构成明显可见的凝集块为细菌构成明显可见的凝集块为“+ +；孔内上；孔内上清液透明度只达清液透明度只达25%；仅有小部分细菌构成小凝块；仅有小部分细菌构成小凝块为为“+，孔内液体均为混浊；无凝集块，细菌沉于孔，孔内液体均为混浊；无凝集块，细菌沉于孔底呈白色圆点状，边缘明晰为底呈白色圆点状，边缘明晰为“。图示。图示肥达反响结果图肥达反响结果图 血清的凝集效价滴度：

26、是指能与一定量血清的凝集效价滴度：是指能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集即的抗原发生肉眼可见的明显凝集即“+凝集凝集的血清最高稀释倍数。血清效价代表血清中抗体的血清最高稀释倍数。血清效价代表血清中抗体的含量，血清效价越高，所含抗体的量愈多。普的含量，血清效价越高，所含抗体的量愈多。普通以为，伤寒沙门菌通以为，伤寒沙门菌“O抗体凝集效价在抗体凝集效价在1：80以上，以上，“H抗体在抗体在1：160以上，甲、乙型副伤以上，甲、乙型副伤寒沙门菌凝集效价在寒沙门菌凝集效价在1：80以上才有诊断价值。以上才有诊断价值。操作步骤ELISA2. 特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫分散法、免