M2巨噬细胞源性外泌体促进血管内支架植入后血管组织修复过程中血管平滑肌细胞的c-KIT表型

1、M2巨噬细胞源性外泌体促进血管内支架植入后血管组织修复过程中血管平滑肌细胞的KIT表型导读对丁-成功的血管内支架植入，血管组织的修复和治疗过程至关重要的。在血管组织修复过程中， 巨噬细胞对血管平滑肌细胞（VSMCs ）具有重要的命运调控作用，己证实Ml巨噬细胞来源的外泌体加 重 了新生内膜增生，但H2巨噬细胞外泌体对VSMCs的作用机制仍未明确。本研究发现血巨噬细胞衍生的 外泌体（M2Es）介导VSMCs细胞间相互作用并诱导去分化表型。M2Es通过激活c-Jun/激活蛋白1 （AP-1 ）信 号通路来上调VSMCs c-KIT表达促进c-KIT表达和附近VSMCs的软化，加速血管组织修 复过程

2、。强调了 M2E通过激活c-Jun / AP-1 fd号通路在VSMC去分化和血管组织修复中的重要作用，对冠状动脉支架技术 的治疗策略具有深远的影响。结果1血管内支架植入后，M2巨噬细胞与c-KIT + VSMCs相邻通过将316L裸金属支架（BMS）从左动脉植入SD大鼠的腹上动脉，鉴定c-KIT + VSMCs在支架 植入 部位的存在和位品。免疫荧光图像显示支架植入后第7天，新内膜中有大虽SM22Q+细胞表达c-KITo支架 昼入后第28天，在支架支杆周围发现很少的c-KIT- rSM22 a +细胞，而在新内膜的支架丝周圉发现了大 虽的c-KIT和SM22 a双阳性细胞，且内膜SM22 a

3、 +细胞中的c-KIT和SM22 a双阳性 细胞在支架且入后7 天和28天分别从13. 61%显着增加至63. 78%。为分析修复区域与c-KIT +细胞 之间的关系，研究者沿着 支架血管的近端直至远端检测c-KIT +细胞的分布（图1A）。通过表而染色，发现位丁 -支架血骨远端 的支架支柱周围有6. /磁的C-KIT+细胞（图1B和1D）,而在支架血管的近 端和中间部位，c-KIT +细胞 占比分别为不到战和1. 79购接卜来，研究者对腹上动脉支架内的CD6s进行表面染色，以进一步研究 巨噬细胞的出现和定位是否与c-KIT + VSMCs同步。支架植入后第7天，在支架植入节段的远端发现了 C

4、D68+细胞，而正常腹上动脉中CD68阳性细胞较少（图1C）。在支架植入血管的远端发现每平方电米有 近60个CD68阳性细胞（图1E） 口通过免疫组织化学的方法在植入支架的血管远端检测到MAC-2 （总巨 噬细胞的标记）和YM-1 （血巨噬细胞的标记。在新内膜支 架周围发现了 MAC-2 +细胞和YM-1 +细胞。 且在支架置入后7天和28天,YM-1 +细胞可进一步深入 到正在发育的新内膜并与VSMCs相邻。支架植入 后7天和28 7 ；，正在发育的新内膜中MAC-2 +细胞分别为8. 77 + 0. 64%和2. 23 + 0. 20% ； YMT +细胞 分别为7. 32±0.

5、45%和1. 43±0. 14%。这些发现表明，M2巨噬细胞町能是c-KIT +细胞参与支架植入后损 伤应答的笑键调节剂。图c-KIT +和CD6S +细胞在带支架的大鼠腹主劫脉血管的分布2巨噬细胞通过胞外囊泡与VSMCs交流研究者卜一步建立了 Trans拓”1共培养系统，以探索巨噬细胞是否可以增强VSMCs的祖细胞形 成。将带有荧光染料的初始巨噬细胞（MO）、LPS +IFN-Y刺激的巨噬细胞（Ml）和ILT + IL-13刺激的 巨噬细胞（M2）与经DIO染色的A7R5共培养24小时。与各种巨噬细胞共培养后,A7R5细胞的形态 从长纺 锤形转变为多边形。A7R5 VSMCs中红色

6、荧光DH染料的出现表明经DI I着色的细胞膜从Transwell上部的 巨噬细胞传递到接种在卞部孔的受体VSMCs中。与H（）和Ml巨噬细胞胞外猱泡（EVs ）相比，VSMCs倾 向于从M2巨噬细胞吸收更多的EVs。但只有与M2巨噬细胞共培养的大鼠上动脉平滑 肌细胞（RASMCs） 才表现出DII染色的细胞膜明显聚集。A7R5的立体坐标视图确认了来门M2巨噬纽I胞的EVs己被整合 到细胞中。3 M2巨噬细胞上调c-KIT的表达并降低VSMCs的细胞硬度通过免疫染色检测干细胞标志物c-KIT之后，在共培养模型中发现卜-室VSMCs的c-KIT上调（图 3A）。同时利用蛋白质印迹分析VSMCs与巨

7、噬细胞共培养后其c-KIT, a ”SMA和SE22 a蛋白水平，结果 显示与M2巨噬细胞共培养的RASMCs中c-KIT表达上调，但a -SMA和SM-22 a表达水平卜调。此 外，与 M0和Ml巨噬细胞EVs处理组相比，吸收M2巨噬细胞EVs的VSMCs具有F-肌动蛋白骨架解聚 作用（图 2C）。硬度变化可以间接反映VSMCs的去分化。研究者利用胶体探针原子力显微镜（AFM）来验证巨噬细 胞是否可以调节VSMCs的硕度。首先利用巨噬细胞条件培养基（M2巨噬细胞上清液：DMEM=1 ： 9或 通ii Transwell共培养刺激RASMCs,当球形和RASMC接近时的力曲线表明，在M2巨噬细

8、胞刺激卜，RASMCs 力曲线的斜率较小（图2D） , 丁 PK软件分析显示，在条件培养基刺激或与M2巨噬细胞共培养 后,RASMCs的硬度显著降低（图2E）。用10 MM GW4869 （一种外泌体生物发生/释放抑制剂）预处理THP-1巨噬细胞，而后进行了 IL-4 + IL-13刺激。发现当GW4869抑制巨噬细胞分泌外泌体后，与H2巨 噬细胞共培养的VSMCs的c-KIT表达并没有上调。在mRNA水平上，外泌体抑 制后，c-Kit. SJI22Q和a- SMA的表达恢复到对照组水平。这些实验表明，M2巨噬细胞源性外泌体町 上调经刺激M2巨噬细胞后 VSMCs中c-KIT的表达。B OAP

9、./CK.W.M2TMerge EnlargednoC DAPIF-Act inDllNCMOT7006005004003002001000-100o003OSSVM.d J。(ed) snsPOUJ sCDunoAE004000 20o00-1.5 -1-0.5 0 0.5 1 1.5 2 Vertical Tip Position (pm)图2. M2 噬细胞上调c-KIT的表达并破坏肌动蛋口骨架.降低VSMCs的细胞皱度4. M2巨噬细胞分泌的外泌体促进VSMCs去分化,进而促进血管修复透射电子显微镜（TEM）（图3A）和纳米粒子跟踪分析（NTA）（图3C显示，M2巨噬细胞上清液中 提取

10、的外泌体直径约为10（） nmo为证实VSMCs可直接乔噬外泌体，将标记有17nm金纳米颗粒的外泌体与 RASMCs孵育12小时。17mn金纳米颗粒标记的掩泡被VSMCs fF没，并可以通过TEH检测到（图3B） o任休外，随时间进行VSMCs吸收更多经DID染色的M2Es。同时,VSMCs的F-肌动蛋白丝 被解聚 并重新排列（图3D） °处理24小时后，M2Es内化的VSMCs的3D图像显示F-肌动蛋白的解聚发生在DID染 色的M2Es周围（图3E）。时间动态检测显示，在24小时后DID染色的M2Es吸收达到 最大值（图3F）。 VSMCs与纯化的M2Es共培养，以阐明M2Es是否

11、在VSMCs中诱导祖细胞的增强和硕 度变化。与对照组相 比,与M2Es共培养的RASMCs明显比正常RASMCs更软。T ./ + / ，/ too Diameter (nm)F-Actin£3lo<q< JaqEnN/15E*63E，82E-81E*81000 -joM2E/ /i；Ya/VJ1001000Diamotor (nm) Merge Enlarged12 h-EnlargedDAPI/ /DIDM2E6 4 2 0 soss'XCUJCNZPaAP QQ F J。Mlsusu- aoueosaonE图3,外泌体介& M2巨噬细胞和VSMCs

12、Z间的细胞交漩未经处理和经M2Es处理的RASMCs杨氏模量分别为130S + 49. 91 Pa和232. 3 +14. 76 Pa （图4A和 4B） o暴露于M2Es之后,VSMCs也会逐渐变为球形。长轴与短轴的比率从5. 620±（）. 3676降低到2. 161 + 0. 1652- P3-RASHCS的F-肌动蛋白骨架经H2Es处理后被破坏（图4C）。接卜来，研究者假 设M2Es可 能在蛋白质水平上引起VSMCs去分化'用M2Es处理24小时后，VSMCs具有高水平的c«KIT表达，且VSMCs 中SM22U的丝状结构不再存在（图4D）。通过蛋白质印迹法

13、检查了未处理和H2E刺 激的RASMCs中c-KIT, SM22O和a-SMA的蛋白水平。结果表明» M2Es刺激组c-KIT表达高度上调，SM22 a和a -SMA被卜调（图4E和4F）。M2Es刺激或与M2巨噬细胞共培养后，RASMCs中SM22 a和a -SMA的表达显著降低，而干 细胞标志物c-Ki t显着增加。未检测到其他两个标记Sea-1和Oct-4 （图4G）。这些数据强烈表明M2Es 对RASHCs公分化至关重要。C DAPI5Vertical Tip Position (pm)NC ExosomeF-ActinMergeDAPIc-KIISM22aMergeEnla

14、rged view图1. M2 i噬细胞分泌的外泌体降低r SMCs的硬嗖并促进SMCs £分化研究者假设任大鼠模型中腹上动脉支架植入后，M2Es町以增强VSMCs的血管修复能力。形态计虽分 析发现与对照组相比，在7天和28天时用M2Es处理的支架血管的新内膜面积有所增加,但在7天和28 天时，新内膜厚度和新内膜与内膜的比率无明显差异。在第7天，与对照组相比，M2Es处理的支架血 管狭窄百分比显著增加。此外，在7灭和28天时总血管而积和内侧而积无显著差异。与PBS处理相 比，M2Es处理的大鼠在28天时在新内膜中包含更多的MAC-2巨噬细胞，并在7天和28天时具有更高的 YH-1 +

15、巨噬细胞。这些数据表明M2Es导致支架血管内的炎症细胞表型改变。经H2Es处理大鼠的新内膜 病变在7灭和28天时含有更多的c-KIT和SM22a双阳性细胞（图5A-C。与PBS处 理相比，H2Es处理的 大鼠在第7天和28天时新内膜中含有更多的c-KIT +和SM22 a ,从而降低了内膜中的SMCs （图5D）。 但对培养基中的细胞进行定虽，未观察到细胞公分化的差异。免疫组织化学显示，与PBS处理组相 比,H2Es处理组新内膜中发现的IWA +细胞更多。00zADAPISM22ac-KITMergew o e N £ss <u o a N£ 更 o。EQS Epu。

16、1，诅SQU图5. M2Es在大鼠腹主动脉支架植入模型中促进VSMC去分 化5 AP-1的增加介导RASMCs的去分化研究者通过RNA-seq比较RASMCs和与M2巨噬细胞共培养的RASMCs基因表达谱，以进一步表征与H2 巨噬细胞共培养的RASMCs。KEGG富集分析显示与此相关的途径是MAPK信号传导、内乔作用、粘着斑、细 胞衰老、流体切应力、动脉粥样硬化和门噬。基丁 -这些发现，推测MAPK途径在VSMCs分化过程中起重 要作用。与M2巨噬细胞共培养的RASMCs中上调的基因与已知的干细胞特征相关（Kitlg. Cd44, Soxl7, Klf4. Xkx-5, F1M和Rexol ）

17、（图6A）。此外，SHC特征性基因在与H2巨噬细胞共培养的RASMCs中被 卜调（图6A）。尽管RNA-seq并未检测到与M2巨噬细胞共培养的RASMCs中c-Ki t的水平变化，但qRT-PCR 确实发现经M2Es处理的RASMCs中c-Ki t有所增加（图9B）。生 物信息学分析显示，在与M2巨噬细胞共 培养的 RASMCs 中 » MAPK / AP-1 途径基因（Sosl. Sos2. Rras2, Kras» Xras» Rras, Braf» Map2kl» Rps6kal» Rps6ka2» Fos和Fos 1

18、1）的表达显著增加，表明AP1活性增加。且AP-1活性增加町能是M2Es诱导的RASMCs 公分化的原因。qRPCR证实Fos 11和其他AP-1依赖性基因在吸收M2Es的RASMCs中高表达（图6B）。M2Es 处理的大鼠在7天和2S天与PBS处理组相比，新内膜中高表达APT （图6C）（，研究者进一步使用T-5224 （AP1的特异性抑制剂）探 究AP-1是否在VSMCs去分化过程中发挥功能性作用。qRT-PCR证实5224任 M2Es处理的RASMCs中有效抑制AP-1活性（图6Do在存在M2Es和T-5224 （ 10 UM）的条件下培养24小时 后,RASMCs中的MAPK / AP-1通路基因和干细胞相关特征性基因被卜调，而SMC