共聚焦操作流程

1、实验环境观察仪器是否有外表明显损坏，如需开启空调，一般控制在25度。 拉上窗帘，避免标本荧光淬灭及杂光干扰。八开机查看实验记录，确认是否马上能开机（注意：汞灯必须在关机20分钟以后才能再开启，般为30分钟）。确认后可执行以下操作： （务必先开电源，后开钥匙！ ！ ！）。1、 打开PSU（主电源）2、 打开激光器（只开启需使用的激光器）1）、鼠离子多线激光器（ 458/488/515 ,应用染料： GFP/FITC/Fluo3/Alexa488/CFP/YFP 等）。2） MCPSU半导体综合激光器（LD405应用染料： DAPI/Hoechst/BFP 等；LD635应用染料：CY5/ Ale

2、xa647 等）。3） LD559激光器（注意：电源打开后不要马上开钥匙，等待 TEMP指示灯不闪烁后，再开钥匙，红色指示灯不闪烁后， 可正常使用）。3、 打开显微镜电源IX2-UCB4、 打开荧光汞灯（注意：开启后，“15分钟内勿关”）5、 打开电脑主机、显示器，登陆 windows xp系统User ID： AJministratorPassword: todew双击共聚焦软件打开FV10-ASWE用User ID: Administrator软件Password:血脑取图1、 DIC （微分干涉差）明场立体图（1）、插入起偏镜、检偏镜（DIC滑块）（2）、FV10-AS漱件中点击透射光观

3、察按钮打开卤素灯快门，使用TD滑块（软件TD lamp项）控制卤素灯的光强，倒置显微镜下观察标本，进行标本聚焦1 ）、使用手控面板选择合适倍率的物镜下观察（注意若用60X油镜时，检偏镜部位要推上弯杆），并检查各物镜对应的DIC元件。2）、可在检偏镜部位用旋钮进行对比度的调节。（需要时可使用，一般勿调）（3）、FV10-ASW软件中点击透射光观察按钮L关闭卤素灯快门。打开DIC通道，执行取图操作。1）、调节扫描速度至最快（2.0us/pixel）, size为512by,点击.的的事,进行快速预扫，寻找焦平面。步骤：适当调节HV、gain 及 ofset 参数扁"T 士（一般为能看到图

4、像即可），快速调节寻找焦平面，如需放大光学倍数，可适当调节O点击，停止预扫描。2）、选择AutoHV,放慢扫描速度（扫描速度越慢，扫描时间越长，图像信噪比好，但耗时，易淬灭，一般为 10-12.5 us/pixel）, size为640by,点击方刖阳第进行再预扫,调节HV、gain及offset参数至图象清晰尖锐即可。点击3）、若背景噪音仍过多也可选上来降低随机噪音干扰（次数越多降噪越好，但扫描时间也越长，一般在HV较高时使用）。4）、点击.进行取图，并保存。（注意：原始图像-定要保存为oib格式）5）、去掉Filtei MoleK.diihui,将扫描速度、size恢复至初始状态（扫描速度

5、至最快,即最左端，2.0us/pixel , size为512by）,为下一个标本做好准备。2、荧光图（1）、拉出检偏镜（DIC滑块），打开汞灯机械快门（shutter）。（2）、FV10-ASW软件中点击汞灯观察按钮,打开汞灯快门，倒置显微镜下观察标本，进行标本聚焦（找视野）。使用手控面板，根据标本荧光探针选择合适的荧光虑色片及选择合适的物镜下观 察，WU紫外激发/蓝色荧光（eg: DAPI）, WB蓝色激发/绿色荧光（eg: FITG EGFP , WG 绿色?敢发/红色荧光（eg:Texas Red Rhodamine , DsRed> （一般要求标本在所用的各种荧光探 针匹配的荧

6、光虑色片下均能观察到所需视野，eg: DAPI+FITC+ Texas Re彤色荧光探针，需在WU,WB,WG下均能观察到所需视野，DAPI 一般荧光较强，FITC或Texas Red下易找些）。（注意：更换不同倍数物镜时应适当降低物镜再更换，以免损坏物镜；若用60X油镜时，要插入检偏镜并推上弯杆。）1）、点击（3）、FV10-ASW软件中点击汞光观察按钮 V ,关闭汞灯快门。执行取图操作。,添加荧光染料。（最多为三色，多于三色需分别扫描）若标本使用的荧光染料不是染料库里的染料，可选激发光及发射光谱较接近的染料代替，这时可适当 调整2）、调节扫描速度至最快（2.0us/pixel）, size

7、为512by,点击所网«对,进行快速预扫，寻找焦平面。步骤：适当调节 HV、gain及offset快速调节般为能看到各通道图像即可）寻找焦平面，如需放大光学倍数，可适当调节。点击停止预扫描。3）、选上* 5懂Fnune （双染以上一定要选上，可避免激发光串色）AutoHV （AutoHV功能为自动匹配扫描速度与HV值，不选易造成图像出现强度过饱和状态）放慢扫描速度（一般为10-12.5 us/pixel ） , size为640by,点击画刖进行再预扫，调节HV、gain及ofset参数至图象清晰尖锐即可。点击,停止预扫描。4）、若背景噪音仍过多也可选上Filtei Mot帕 Kti

8、hi-in来降低随机噪音干扰 （次数越多降噪越好，但扫描时间也越长，一般在 HV较高时使用）。5）、点击.进行取图，保存及相关图像处理。（注箴原始图像-定要保存为oib格式）Ht«r Mole6）、去掉 Klim。"，将扫描速度、size恢复至初始状态（扫描速度至最快，即 最左端，2.0us/pixel , size为512by）,为下一个标本做好取图准备。四、刻录数据图像保存后，退出 FV10-ASW软件，刻录数据（注意：必须用新的光盘，严禁使用U盘、移到硬盘等）。五、关机务必先关钥匙后关电源！ !1、关闭荧光汞灯（注意：开启后，“15分钟内勿关”）2、关闭激光器1）、关闭LD559激光器2）、关闭MCPSU半导体综合激光器3）、僦离子多线激光器 （注意：先关钥匙，千万别马上关闭电源，要等风扇停止转动后 再关闭电源）3、使用擦镜纸沾擦显微镜物镜（注意：一般物镜清洗液为乙醇，擦镜纸为普通擦镜纸；油